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文檔簡介
1、隨著人們對食品安全的重視程度的增加，生產(chǎn)食品工業(yè)重要配料海藻糖所必需的海藻糖合酶（trehalose synthase，E.C.5.4.99.16）已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是安全分泌表達(dá)外源蛋白的宿主菌。然而，大部分的外源蛋白在B. subtilis表達(dá)系統(tǒng)中的分泌量都是非常低的，理論上蛋白質(zhì)從生產(chǎn)到轉(zhuǎn)運(yùn)每一步都有可能是得率不理想的原因，本文從調(diào)控元件啟動子和信號肽的適配及發(fā)酵條件的優(yōu)化兩方
2、面入手以期提高外源蛋白的分泌效率。
本研究通過基因工程的手段，將來源于施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri Qlu3）的海藻糖合酶基因序列（tres）與B. subtilis Sec分泌途徑中的SPNprE信號肽基因序列構(gòu)建到B. subtilis表達(dá)載體pHT01上，成功構(gòu)建B. subtilis信號肽篩選載體。同時(shí)用一種半理性分析方法篩選出另外6種 Sec途徑信號肽，SPAprE、SPamyE、SPwap
3、A、SPSacB、SPvpr和SPyvgO，替換到構(gòu)建好的信號肽篩選載體中。利用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到B. subtilis蛋白酶缺陷型菌株WB800N中，通過HPLC對重組菌發(fā)酵液上清進(jìn)行檢測，篩選到一種引導(dǎo)海藻糖合酶較高效分泌的信號肽 SPNprE，胞外酶活為14.5U/mL。之后選擇較強(qiáng)的啟動子PaprE來控制tres的轉(zhuǎn)錄，胞外酶活提高0.7倍，為24.8U/mL。對搖瓶發(fā)酵產(chǎn)海藻糖合酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化，研究以TB培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基
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