厭氧降解纖維素產(chǎn)乙醇菌群的篩選鑒定及發(fā)酵條件分析.pdf

1、本研究從內(nèi)華達(dá)州大盆地溫泉采樣，以纖維素為底物富集厭氧纖維素降解菌群，篩選獲得高效纖維素降解厭氧兩個(gè)菌群SV47和SV79。選其中降解纖維素能力較高的菌群SV79作為研究對(duì)象，以濾紙條為唯一碳源對(duì)菌群SV79進(jìn)行15次傳代純化，獲得了菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的厭氧菌群SV79。分析該菌群的最佳底物降解條件和產(chǎn)纖維素酶條件，結(jié)果表明：在培養(yǎng)基的初始為pH8.0，溫度為42℃，底物添加量為1 g/100 mL，接種量為1％，裝液量100 mL，培養(yǎng)72

2、h時(shí)，產(chǎn)酶量達(dá)到最大。此時(shí)，纖維素降解率達(dá)到51.3％～68.2％，最大酶活為：濾紙酶活9.125U/mL；CMC酶活為9.89 U/mL；β-葡萄糖苷酶為7.70 U/mL。對(duì)菌群SV79發(fā)酵液進(jìn)行粗酶純化，經(jīng)硫酸銨沉淀和Sepharose CL4B凝膠柱層析梯度洗脫后，SDS-PAGE檢測(cè)得到單一的電泳條帶，分子量約為42 kDa，測(cè)定CMC酶活為13.69 U/mL。CMC酶活的最佳反應(yīng)pH為8.0，最佳反應(yīng)溫度為52℃。對(duì)自然界

3、不同形式的纖維素進(jìn)行降解研究發(fā)現(xiàn)：菌群SV79不但能夠分解濾紙條、CMC、稻草、廢菇筒，同時(shí)在這一過(guò)程中產(chǎn)生了乙醇，經(jīng)氣相色譜分析表明以濾紙為底物時(shí)SV79產(chǎn)乙醇含量最高值可達(dá)1.97 g/L；以CMC、廢菇筒和稻草為底物產(chǎn)乙醇含量分別為：1.19 g/L、0.74 g/L和1.14 g/L。 通過(guò)16S rDNA技術(shù)分析確定了菌群SV79的結(jié)構(gòu)，將獲得的16個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)NCBI上BLAST序列比對(duì)，結(jié)果顯

4、示菌群SV79包含有三個(gè)屬Clostridium sp.；Ruminococcus sp.；Sporomusa sp.。其中Clostridium sp.為優(yōu)勢(shì)菌，占整個(gè)菌群的75％；Ruminococcus sp.占整個(gè)菌群的20％；Sporomusa sp.占整個(gè)菌群的5％。 厭氧菌的作用是纖維素降解產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，厭氧菌產(chǎn)生多種酶類并在多酶復(fù)合體的協(xié)同作用下催化纖維素分解，最終實(shí)現(xiàn)纖維素到乙醇的轉(zhuǎn)化過(guò)程。嗜熱菌獨(dú)具原位產(chǎn)

5、纖維素酶的能力，較之以酵母菌為基礎(chǔ)的產(chǎn)乙醇系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，而這一特點(diǎn)使其在乙醇生產(chǎn)中具有優(yōu)勢(shì)。 目前，許多研究是通過(guò)獲得純培養(yǎng)物的方式來(lái)篩選纖維素降解菌，但這種傳統(tǒng)的分離純化方法有諸多的局限性：首先，很多細(xì)菌目前為止還難以獲得純培養(yǎng)；另外，有些細(xì)菌之間存在互利共生的原始合作關(guān)系，尤其是厭氧纖維素降解菌，從而難以獲得單菌。本研究直接從環(huán)境中篩選降解纖維素的菌群，以菌群為對(duì)象，研究其降解纖維素、產(chǎn)乙醇能力及菌群結(jié)構(gòu)，對(duì)構(gòu)建高效率產(chǎn)乙醇人工