2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、眼睛的發(fā)育和生成取決于“眼睛決定基因網(wǎng)絡(luò)”(Retinal Determination Gene Network,RDGN),此網(wǎng)絡(luò)由高度保守的基因組成,能夠編碼對(duì)于眼睛生成必不可少的轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)的輔助因子。Eya absent(Eya)和Sine oculis(So)是RDGN的重要成員,兩者可以相互結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物,在果蠅乃至人類的多種發(fā)育過程中起作用,包括細(xì)胞的分化、增殖和存活等。Eya既是轉(zhuǎn)錄共激活子也是蛋白磷酸酶,而它

2、的結(jié)合蛋白So行使轉(zhuǎn)錄因子的功能。已有的研究表明,eyα和so基因?qū)τ诠壍拇婊詈脱劬Φ纳墒潜仨毜?,過量表達(dá)還能誘導(dǎo)易位眼的生成。盡管eyα和so在后生動(dòng)物發(fā)育中的地位如此重要,但目前對(duì)其調(diào)節(jié)及其作用的機(jī)制卻知之甚少。鑒此,我們的研究立意于從兩個(gè)方面拓展對(duì)Eya和So的認(rèn)識(shí)和了解:利用基因組拯救系統(tǒng)對(duì)Eya進(jìn)行結(jié)構(gòu)一功能分析;并應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀聯(lián)合高通量測(cè)序(ChIP-seq)篩選So全新的靶基因。主要研究成果如下:
  

3、 研究發(fā)現(xiàn),Eya的酪氨酸磷酸酶活性對(duì)于果蠅的發(fā)育和存活不是必須的。果蠅的eyα基因編碼3種不同的蛋白亞型,這三種亞型都含有兩個(gè)主要的功能結(jié)構(gòu)域:高度保守的編碼271個(gè)氨基酸的碳端結(jié)構(gòu)域,即Eya Domain1(ED1);中度保守的Eya Domain2(ED2),它存在于一個(gè)富含脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸的區(qū)域(PST)中。ED1保守結(jié)構(gòu)域具有酪氨酸磷酸酶活性,體外催化活性檢測(cè)顯示小鼠和果蠅,甚至植物Eya都具有此活性。但不同的是,果蠅

4、Eya的酪氨酸磷酸酶活性很低,難以檢測(cè)。大量已有研究結(jié)果表明,Eya酪氨酸磷酸酶功能參與調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的發(fā)育過程。在果蠅中,相應(yīng)活性位點(diǎn)的突變會(huì)導(dǎo)致酪氨酸磷酸酶活性急劇下降或喪失、基于eyα cDNA的異位眼誘導(dǎo)率和遺傳拯救率大幅度降低。另外,Eya酪氨酸磷酸酶活性還參與感光細(xì)胞軸突的定位。雖然以上研究表明Eya酪氨酸磷酸酶活性可能在果蠅眼睛發(fā)育過程中行使功能,但是這一假設(shè)卻未在能精確模擬內(nèi)源eyα表達(dá)量、表達(dá)空間、表達(dá)時(shí)間上的系統(tǒng)中檢測(cè)

5、過。
   基于以上分析,我們構(gòu)建了3種酪氨酸磷酸酶失活型eyα基因組拯救質(zhì)粒。前兩種是單點(diǎn)突變,利用兩步式重組法在野生型eyα基因組拯救質(zhì)粒(eyα+GR)上引入點(diǎn)突變D493-N(GAT->AAT)和E728-Q(GAG->CAG),即eyαD493N GR和eyαE728QGR。為了研究D493N、E728Q兩種點(diǎn)突變同時(shí)作用的效果,我們又構(gòu)建了第三個(gè)質(zhì)粒,eyαNQGR(下文中統(tǒng)稱為eyα*GR)。通過ΨC31整合酶系統(tǒng)

6、介導(dǎo)eyα基因組拯救質(zhì)粒上αttB位點(diǎn)和果蠅第三條染色體上αttP位點(diǎn)之間的重組,從而將eyα基因組拯救質(zhì)粒整合于果蠅體內(nèi)。然后通過一系列雜交,檢測(cè)在眼特異性突變eyα2(果蠅存活但是無眼)背景下和eyα無效突變eyα clillD/Df(2L)BSC356(果蠅無內(nèi)源性eyα,胚胎致死)背景下,eyα*GR對(duì)果蠅發(fā)育和存活的影響。與已有報(bào)道相悖,我們的研究結(jié)果表明,Eya的酪氨酸磷酸酶活性對(duì)于果蠅的發(fā)育和存活無影響;轉(zhuǎn)基因拯救型果蠅表

7、現(xiàn)出正常的繁殖能力、生活力、復(fù)眼內(nèi)外部表型、眼成蟲盤發(fā)育、眼對(duì)光的反應(yīng)和感光細(xì)胞軸突定位。
   針對(duì)Eya特異性結(jié)構(gòu)域和特定位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)一功能研究已經(jīng)有所開展,并取得了初步進(jìn)展。但是,以往的研究具有一定的缺陷,其主要基于cDNA轉(zhuǎn)基因技術(shù)(異位眼誘導(dǎo)、熱激誘導(dǎo)等)——基因在表達(dá)的時(shí)間、空間和表達(dá)量上都與內(nèi)源基因的表達(dá)不一樣。我們的研究結(jié)論改變了人們對(duì)Eya功能已有的根深蒂固的認(rèn)識(shí),并指出了在生物正常發(fā)育系統(tǒng)中研究基因功能的重要性

8、,也為將來Eya蛋白以及其他蛋白功能的研究提供了新思路。
   研究揭示,Eya的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域?qū)τ诠壍陌l(fā)育和存活是必須的。Eya的PST結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)ED2結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)MAPK磷酸化位點(diǎn)。ED2位于PST結(jié)構(gòu)域的中央位置,研究發(fā)現(xiàn)其具有蘇氨酸磷酸酶活性,能夠參與果蠅和哺乳動(dòng)物固有免疫的調(diào)節(jié),但不調(diào)節(jié)發(fā)育過程。關(guān)于MAPK磷酸化位點(diǎn),最新的體內(nèi)研究表明,這兩個(gè)位點(diǎn)磷酸化與否對(duì)果蠅的發(fā)育和存活沒有影響。體外熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)E

9、ya的轉(zhuǎn)錄活性,發(fā)現(xiàn)不論是在果蠅還是小鼠中,PST結(jié)構(gòu)域?qū)τ谵D(zhuǎn)錄激活是必須的。另外,缺失整個(gè)PST結(jié)構(gòu)域會(huì)導(dǎo)致eyα異位眼誘導(dǎo)率急劇下降。雖然PST結(jié)構(gòu)域?qū)τ贓ya行使轉(zhuǎn)錄激活功能十分重要,缺失會(huì)影響果蠅異位眼發(fā)育,但是此結(jié)構(gòu)域卻未在正常發(fā)育系統(tǒng)中檢測(cè)過。
   基于以上分析,我們利用一步重組法構(gòu)建了PST結(jié)構(gòu)域缺失型eyα基因組拯救質(zhì)粒,簡(jiǎn)稱eyαΔPST GR。與整合酪氨酸磷酸酶失活型eyα*GR一樣,通過ΨC31整合酶系統(tǒng)

10、,將eyαΔPSTGR插入果蠅第三條染色體的αttP位點(diǎn)上。然后,通過一系列雜交實(shí)驗(yàn),檢測(cè)在眼特異性突變eyα2背景下和eyα無效突變 eyclillD/Df(2L) BSC356背景下eyαΔPST GR對(duì)果蠅發(fā)育和存活的影響。我們的基因組DNA拯救實(shí)驗(yàn)和FRT-FLP嵌合克隆分析結(jié)果表明,eyαΔPST GR無法拯救eyα眼特異性突變和無效突變。RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示突變基因eyαΔPST在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上都

11、有表達(dá),另外免疫組化染色表明檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)越早,蛋白表達(dá)水平越接近野生型。這說明拯救失敗并不是Eya蛋白無表達(dá)造成的,而是由于PST結(jié)構(gòu)域缺失造成的。換言之,eyα的PST轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域?qū)τ诠壍拇婊詈桶l(fā)育是必須的。
   研究表明,So參與調(diào)節(jié)與果蠅眼睛發(fā)育相關(guān)的多個(gè)基因。轉(zhuǎn)錄因子So是被廣為認(rèn)可的Eya結(jié)合蛋白,So是SIX(Sine oculis homebox)轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員,存在于所有的后生動(dòng)物中并行使重要功能,

12、它具有2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域:199個(gè)氨基酸的SIX結(jié)構(gòu)域(SD),參與調(diào)節(jié)蛋白間互作;60個(gè)氨基酸的DNA結(jié)合同源結(jié)構(gòu)域(HD)。在果蠅中,So對(duì)于果蠅的存活、精子發(fā)生和整個(gè)視覺系統(tǒng)(包括眼睛、視葉、幼蟲的視覺器官)的發(fā)育是必不可少的。盡管So地位重要,我們對(duì)其直接作用的靶基因卻知之甚少,大多數(shù)己知的So靶基因都能編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,參與眼睛發(fā)育。
   為了更好地了解So調(diào)節(jié)眼睛發(fā)育的機(jī)制,我們聯(lián)合染色質(zhì)免疫共沉淀和高通量測(cè)序(ChI

13、P-seq),通過對(duì)三齡期眼成蟲盤上DNA與So蛋白相互作用的全基因組分析,我們發(fā)現(xiàn)了7566個(gè)So富集區(qū)域,大約5400個(gè)基因,其中也包括已經(jīng)被報(bào)道的So靶基因。另外,qPCR結(jié)果也再次驗(yàn)證了So ChIP-seq指出的靶基因。應(yīng)用基因本體論(GO)進(jìn)一步分析這些So結(jié)合基因并從中選取了一部分與眼睛發(fā)育相關(guān)的基因,通過ey-flp/FRT技術(shù)對(duì)它們的突變型進(jìn)行分析,最后篩選出了8個(gè)全新的So靶基因。
   這8個(gè)靶基因的基因突

14、變顯示出不同的眼表型,有的是粗糙眼,但是眼睛大小無變化;有的是幾乎整個(gè)眼睛都缺失——這反映了So參與眼睛發(fā)育的多個(gè)階段,從細(xì)胞存活到MF的發(fā)生和發(fā)展。這些靶基因如下:2個(gè)編碼RNA加工蛋白的基因(omd和Syp);2能夠編碼個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的基因(CG8108 and l(3)j2D3);1個(gè)編碼RabGGT亞基(調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸)的基因(CG12007);1個(gè)編碼跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因(blot);2個(gè)編碼未知功能Armadillo-like

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