成骨細(xì)胞對I型膠原三維結(jié)構(gòu)的影響及其膠原的自組織.pdf

1、在體內(nèi)環(huán)境中，成骨細(xì)胞能夠分泌膠原，并與其他細(xì)胞共同作用，使膠原形成有序的骨雛形，隨后羥基磷灰石等無機(jī)鹽沉積其上，最終發(fā)育成為骨組織。如果這種細(xì)胞對膠原的作用能夠在體外得到重現(xiàn)，就有可能用于骨組織工程材料的設(shè)計(jì)和制作過程。這是一種仿生制造的新思路，值得探索。
　　本實(shí)驗(yàn)希望通過考察成骨細(xì)胞與I型膠原之間的相互作用，探索其規(guī)律，從而探討這種可能性。
　　本實(shí)驗(yàn)采用自行提取SD大鼠尾腱I型膠原，并配制成溶液形式。將原代培養(yǎng)的成骨

2、細(xì)胞與所提取的膠原進(jìn)行共培養(yǎng)，從細(xì)胞形態(tài)、增殖、生理功能等方面考察膠原三維結(jié)構(gòu)對細(xì)胞生理功能的影響，同時(shí)采用組織染色、掃描電鏡、Micro-CT等手段來考察細(xì)胞對膠原三維結(jié)構(gòu)的改變能力，為探索細(xì)胞與材料之間自組織能力提供一定的理論依據(jù)。
　　主要工作如下：
　?、倌z原的提取、純化和鑒定：采用Schor提取法，提取并純化了SD大鼠尾腱I型膠原，通過紅外光譜分析，SDS-PAGE電泳分析，HE染色和Masson染色以鑒定所得膠原

3、的結(jié)構(gòu)和提取純度。結(jié)果顯示，提取物與生友生物公司的I型鼠尾膠原具有相同的分子結(jié)構(gòu)和分子量大??；染色圖片分析結(jié)果表明與I型膠原的組成相同。
　?、诔晒羌?xì)胞原代培養(yǎng)和鑒定：采用組織塊培養(yǎng)法，體外培養(yǎng)新生的Wistar大鼠的成骨細(xì)胞。光鏡觀察細(xì)胞呈現(xiàn)矮柱狀或立方形，表明細(xì)胞狀態(tài)良好。用茜素紅染色結(jié)果表明細(xì)胞具有的鈣質(zhì)分泌能力，具有成骨細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　③ I型膠原對成骨細(xì)胞形態(tài)，增殖等生理功能的影響：設(shè)置0.5mg/ml、1

4、.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、5.0mg/ml、8.0mg/ml共8組膠原濃度的實(shí)驗(yàn)組，用掃描電鏡考察膠原的三維結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)不同濃度的膠原三維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)有所區(qū)別，并非成線性變化，總體趨勢是隨著濃度的增加，膠原內(nèi)部孔隙（以直徑量度）減小，單位面積內(nèi)孔數(shù)增加。采用DAPI染色法，MTT法，及ALP試劑盒檢測這8組濃度膠原對成骨細(xì)胞形態(tài)、增殖存活等生理功能的影響。將成骨細(xì)胞接種于膠原內(nèi)部

5、，取培養(yǎng)2，4，6，8天樣本進(jìn)行MTT檢測，繪制生長曲線結(jié)果顯示，不同膠原濃度內(nèi)細(xì)胞生長曲線有所不同。成骨細(xì)胞在各組濃度膠原內(nèi)部都具有增殖能力，其中，低濃度膠原內(nèi)細(xì)胞活性明顯大于高濃度內(nèi)細(xì)胞。取培養(yǎng)2，4，6天樣本測試其中細(xì)胞堿性磷酸酶活性，通過堿性磷酸酶活性變化率表可以發(fā)現(xiàn)，不同膠原濃度內(nèi)細(xì)胞活性都有增長趨勢。其中，低濃度膠原內(nèi)細(xì)胞活性明顯大于高濃度內(nèi)細(xì)胞。將細(xì)胞生理功能結(jié)果與不同濃度膠原三維結(jié)構(gòu)結(jié)果進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，I型膠原網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中孔

6、徑及單位面積孔隙個(gè)數(shù)能夠影響成骨細(xì)胞生理功能。低濃度時(shí)，膠原網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)孔徑較大，單位面積孔隙個(gè)數(shù)較少，成骨細(xì)胞增殖，堿性磷酸酶等生理功能活性較大。高濃度時(shí)，膠原網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)孔徑較小，單位面積孔隙個(gè)數(shù)較多，成骨細(xì)胞增殖，堿性磷酸酶等生理功能活性較小。
　?、艹晒羌?xì)胞對I型膠原形態(tài)的影響：細(xì)胞接種于膠原內(nèi)部，設(shè)置對照組為相同濃度的膠原溶液，培養(yǎng)2，4，6天后采用DAPI和HE染色，Micro-CT，掃描電鏡考察成骨細(xì)胞對I型三維結(jié)構(gòu)的改變。