自體軟骨細胞復合Ⅰ型膠原支架體外動態(tài)培養(yǎng)的實驗研究.pdf

1、【目的】目前，自體軟骨細胞移植術（ACI）是治療大面積關節(jié)軟骨缺損的首選方法。ACI技術現(xiàn)已發(fā)展到第三代技術，也稱為基質誘導的自體軟骨細胞移植技術（MACI）。然而，MACI技術仍難以生成理想的透明軟骨修復軟骨缺損區(qū)，并且修復效果不穩(wěn)定。因此，如何對MACI技術中軟骨細胞的體外擴增，支架材料，細胞復合支架材料的共培養(yǎng)等條件優(yōu)化改進，成為解決這一問題的關鍵，這也是目前軟骨組織工程研究的熱點。本研究通過比較體外靜態(tài)與動態(tài)培養(yǎng)兩種方式對培養(yǎng)人

2、關節(jié)軟骨細胞復合Ⅰ型膠原支架材料的效果，從而探索體外構建MACI手術中修復關節(jié)軟骨缺損區(qū)移植物的適宜條件及方式。
　　【方法】取人關節(jié)軟骨組織，體外分離消化成軟骨細胞，單層培養(yǎng)擴增至P2代，免疫熒光表型鑒定。將P2代軟骨細胞接種于Ⅰ型膠原支架上，隨機分為三組，A組采用靜態(tài)培養(yǎng)，B組于微重力生物反應器中動態(tài)培養(yǎng)，C組繼續(xù)采用單層培養(yǎng)。體外培養(yǎng)7d后，采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)；熒光顯微鏡、SEM、HE染色觀察細胞在支架上的分布、

3、黏附、生長及形態(tài)特點；實時熒光定量PCR檢測軟骨細胞表型特異基因(COL-2)的表達情況，并進行統(tǒng)計學分析。
　　【結果】體外分離培養(yǎng)的 P2代軟骨細胞倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)呈多角形為主，Ⅱ型膠原蛋白表達陽性，提示 P2代細胞表型維持良好；熒光顯微鏡觀察：與 A組比較，支架內B組細胞數(shù)量較多且分布均勻；SEM觀察示：空白支架多孔結構，A組軟骨細胞在支架表面分布較少，黏附于支架表面，B組軟骨細胞在支架表面大量生長，融合成片，形態(tài)規(guī)則

4、；HE染色結果：空白支架橫斷面內部明顯多層孔隙結構，A、B組樣本大體結構及內部孔隙結構均保持完整，孔隙內均可見細胞黏附，B組孔隙內細胞數(shù)量及細胞外基質優(yōu)于 A組；RT-PCR檢測：A、B組軟骨細胞 COL-II基因表達水平較單層培養(yǎng)組明顯增加，A、B組之間 COL-II基因表達水平無統(tǒng)計學差異。
　　【結論】軟骨細胞與Ⅰ型膠原支架復合后，與靜態(tài)培養(yǎng)相比，體外動態(tài)培養(yǎng)可明顯促進細胞增殖及細胞外基質分泌；與單層培養(yǎng)相比，動態(tài)及靜態(tài)培養(yǎng)