小麥漸滲系SR4堿脅迫應(yīng)答基因TaCCD1和TaStpk-B的功能研究.pdf

1、植物所受到的堿脅迫是由土壤中的Na2CO3和NaHCO3所造成的。與鹽脅迫相比，植物受到的堿脅迫的損傷程度更為嚴重。這是因為堿脅迫除了離子和滲透脅迫，還包含高pH脅迫。至今，人們在植物耐鹽機制研究方面較為廣泛而深入，但是對植物的堿脅迫響應(yīng)機制卻研究較少，亟待加強。
　　山融4號（Shanrong No.4簡稱SR4）是本實驗室利用不對稱體細胞雜交技術(shù)將長穗偃麥草的染色質(zhì)漸滲到普通小麥濟南177中獲得的小麥耐鹽堿新品系。前期通過大田

2、及鹽堿池種植實驗均證明SR4具有很強的抗堿特性并且利用第二代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析小麥山融4號根系堿脅迫響應(yīng)基因，從中篩選出TaCCD1和TaStpk-B進行功能鑒定。
　　1.SR4鈣離子結(jié)合蛋白TaCCD1的功能研究
　　我們以SR4的cDNA為模板克隆到了一個約600 bp的TaCCD1的開放閱讀框。它編碼一種含有EF手型基序motif的鈣離子結(jié)合蛋白。亞細胞定位實驗表明:TaCCD1定位于細胞核和細胞質(zhì)。qRT-PCR分

3、析實驗表明，TaCCD1在不同的脅迫處理條件下表現(xiàn)出不同的表達模式。通過浸花法將TaCCD1轉(zhuǎn)入野生型擬南芥，篩選出兩個表達量較高的TaCCD1過表達純系進行耐逆相關(guān)研究。在堿脅迫處理條件下，TaCCD1 OE系的根較對照Col-0長，表明TaCCD1OE系對于堿脅迫具有抗性。之后的堿脅迫處理萌發(fā)實驗表明TaCCD1 OE系的子葉綠化程度較Col-0高，表現(xiàn)出對堿脅迫的抗性。葉綠素含量測定結(jié)果證明:在經(jīng)堿pH處理之后，野生型植株的葉綠素

4、含量低于過表達植株。上述實驗均證明TaCCD1可以促進植物對于堿脅迫的抗性。在ABA脅迫處理條件下，TaCCD1 OE的根較Col-0長，表明TaCCD1增強了植物對于ABA的抗性。在鹽脅迫處理條件下，TaCCD1 OE的根較Col-0長，表明TaCCD1增強了植物對于鹽脅迫的抗性。在H2O2脅迫處理條件下，TaCCD1 OE的側(cè)根數(shù)目較Col-0多，表明TaCCD1增強了植物對于氧化脅迫的抗性。TaCCD1 OE系體內(nèi)的ROS含量較C

5、ol-0低，且TaCCD1 OE系有較高水平的ROS清除酶活性。進一步分析，證實了依賴ABA的脅迫應(yīng)答基因MYB2、RAB18、RD29B在TaCCD1 OE系中有所上調(diào)，ABA信號通路的正調(diào)控因子ABI5表達量下調(diào);而不依賴ABA的脅迫應(yīng)答基因DREB2A表達量上調(diào)。離子轉(zhuǎn)運載體相關(guān)基因SOS2和HKT表達量上調(diào)。在堿處理條件下，葉綠素合成相關(guān)的基因HEMF2，HEME2，HEMB2，HEME1，CRD1，GSA1，PORA，PORB

6、較Col-0出現(xiàn)上調(diào)表達，而葉綠素分解基因SGR沒有明顯變化。綜上所述，TaCCD1可以通過調(diào)控ROS的積累及鈉離子的轉(zhuǎn)運促進植物對堿脅迫、鹽脅迫和氧化脅迫等非生物脅迫的抗性，且這些抗性可能是通過調(diào)控ABA信號通路來起作用的。此外，TaCCD1通過正調(diào)控葉綠素合成基因的表達賦予過表達植株堿抗性。
　　2.耐鹽堿小麥漸滲系SR4 TaStpk-B的研究
　　我們從SR4中克隆到了一個約1.2 kb的TaStpk-B的開放閱讀框

7、。TaStpk-B編碼的產(chǎn)物是含有Ser/Thr保守結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。亞細胞定位實驗表明:TaStpk-B定位于細胞質(zhì)中。qRT-PCR分析實驗表明，該基因在不同的脅迫處理條件下表現(xiàn)出不一樣的表達模式。通過浸花法將TaStpk-B轉(zhuǎn)入野生型擬南芥，篩選出兩個表達量較高的TaStpk-B過表達純系進行耐逆相關(guān)研究。在堿脅迫處理條件下，TaStpk-B OE系的根較對照Col-0長，表明TaStpk-B OE系對于堿脅迫具有抗性。在NaCl及

8、甘露醇脅迫處理條件下，TaStpk-B OE系的根較Col-0短，表明TaStpk-BOE系植株對于NaCl及甘露醇敏感。TaStpk-B OE系體內(nèi)的ROS含量較Col-0低，且TaStpk-B OE系有較高水平的ROS清除酶活性。TaStpk-B OE體內(nèi)離子轉(zhuǎn)運載體類基因在TaStpk-B OE和對照植物中沒有明顯差別。在鹽處理條件下，過表達系的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸較野生型低。TaStpk-B使得ABA合成的關(guān)鍵基因ABA2顯著上調(diào)

9、表達，依賴于ABA信號通路的調(diào)控因子ABI3，ABI4顯著下調(diào)表達，不依賴于ABA信號通路的Marker基因RD29A顯著下調(diào)表達。綜上所述，TaStpk-B可以通過調(diào)控ROS的積累來應(yīng)對植物所遭受到的堿脅迫，且過表達植物所獲得的堿脅迫抗性可能是通過促進正調(diào)控ABA合成途徑以及負調(diào)控ABA信號通路的負調(diào)控因子來起作用的。而TaStpk-B反向控制不依賴于ABA信號通路的脅迫響應(yīng)RD29A，從而給予過表達植株的鹽敏感以及滲透敏感性。此外，