超高靈敏流式分析技術(shù)在單線粒體檢測中的應(yīng)用.pdf

1、線粒體是細胞生命活動的控制中心,它不僅是細胞的能量中心,而且在多種誘因引發(fā)的細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的調(diào)節(jié)作用。以線粒體為切入點的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究,無論對于揭示細胞凋亡發(fā)生過程的分子機制,還是研究小分子化合物誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用機理,均具有重要價值。與全細胞分析相比,單個線粒體水平上的分析能夠排除其他細胞器的干擾,揭示線粒體功能之間的異質(zhì)性,并有助于線粒體亞類的發(fā)現(xiàn)。然而,由于線粒體尺寸微小,與其功能相關(guān)的生化物質(zhì)含量低以及缺乏靈敏的檢

2、測手段等原因,單個線粒體水平上的檢測一直以來都是一個富有挑戰(zhàn)性的課題。
　　本課題組自行研制的超高靈敏流式檢測儀(High-sensitivity flow cytometer,HSFCM),其靈敏度可達商品化流式細胞儀的數(shù)百倍以上,己在單個納米顆粒水平的檢測以及多個化學(xué)生物學(xué)體系中突顯獨特的應(yīng)用價值。本論文主要基于HSFCM的靈敏度,建立一個能在單細胞器水平對線粒體進行多參數(shù)分析的平臺。文中首先利用熒光探針對線粒體內(nèi)膜、核酸進行

3、標記,在HSFCM上建立了單個線粒體的檢測模式;進而采用免疫熒光的方法對線粒體蛋白進行標記,利用HSFCM嘗試了單線粒體水平的蛋白檢測;并在此基礎(chǔ)上,利用三通道的HSFCM開展了單個線粒體的多參數(shù)分析,在線粒體水平實現(xiàn)了對其純度、結(jié)構(gòu)和功能完整性的全面考察。最后在全面建立的多參數(shù)分析平臺上,將體系進一步推廣至凋亡相關(guān)蛋白的檢測,并初步開展了抗腫瘤藥物作用機理的研究,主要內(nèi)容如下:
　　1.建立以HeLa腫瘤細胞為模型的線粒體提純方

4、法,采用綠色熒光探針NAO對線粒體內(nèi)膜上的心磷脂進行特異性標記,利用HSFCM實現(xiàn)了對單個線粒體的檢測;采用紅色熒光探針SYTO62對線粒體的核酸進行標記,嘗試用NAO和SYTO62兩種熒光探針對線粒體進行同時標記,在HSFCM上初步建立了單個線粒體的檢測模式(第二章)。
　　2.采用免疫熒光的方法對線粒體的外膜穿孔蛋白(porin)進行標記,優(yōu)化線粒體膜蛋白檢測的染色方案;通過優(yōu)化免疫熒光的樣品制備如細胞器的固定、打孔條件等,以

5、位于線粒體內(nèi)膜及膜間隙的細胞色素c蛋白(cyt c)為模型,建立了適用于線粒體內(nèi)部蛋白的免疫熒光標記方法,從而為HSFCM應(yīng)用于單個線粒體水平的線粒體蛋白檢測奠定了基礎(chǔ)(第三章)。
　　3.在已經(jīng)建立的線粒體特異性生化物質(zhì)熒光標記、線粒體蛋白免疫熒光標記和相應(yīng)檢測模式基礎(chǔ)之上,將三通道HSFCM應(yīng)用于單個線粒體的多參數(shù)分析。利用HSFCM檢測NAO和SYTO62熒光探針同時標記的線粒體,實現(xiàn)了對單個線粒體純度和結(jié)構(gòu)完整性的考察;對

6、線粒體的porin和cyt c同時進行免疫熒光標記,利用HSFCM實現(xiàn)了對單個線粒體功能完整性的考察;并在線粒體水平考察了Ca2+刺激所引起的細胞色素c的釋放和線粒體的外膜損傷(第四章)。
　　4.鑒于Bcl-2家族蛋白在線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡中發(fā)揮的重要作用,我們利用HSFCM,在線粒體水平對凋亡相關(guān)蛋白Bax及Bcl-2進行了半定量檢測,并以此為基礎(chǔ),初步開展了線粒體凋亡通路相關(guān)抗腫瘤藥物如:星形孢菌素、樺木酸等作用機理的研究(