超高靈敏流式分析技術(shù)在單線粒體檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、線粒體是細(xì)胞生命活動(dòng)的控制中心,它不僅是細(xì)胞的能量中心,而且在多種誘因引發(fā)的細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的調(diào)節(jié)作用。以線粒體為切入點(diǎn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究,無(wú)論對(duì)于揭示細(xì)胞凋亡發(fā)生過(guò)程的分子機(jī)制,還是研究小分子化合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)理,均具有重要價(jià)值。與全細(xì)胞分析相比,單個(gè)線粒體水平上的分析能夠排除其他細(xì)胞器的干擾,揭示線粒體功能之間的異質(zhì)性,并有助于線粒體亞類(lèi)的發(fā)現(xiàn)。然而,由于線粒體尺寸微小,與其功能相關(guān)的生化物質(zhì)含量低以及缺乏靈敏的檢

2、測(cè)手段等原因,單個(gè)線粒體水平上的檢測(cè)一直以來(lái)都是一個(gè)富有挑戰(zhàn)性的課題。
　　本課題組自行研制的超高靈敏流式檢測(cè)儀(High-sensitivity flow cytometer,HSFCM),其靈敏度可達(dá)商品化流式細(xì)胞儀的數(shù)百倍以上,己在單個(gè)納米顆粒水平的檢測(cè)以及多個(gè)化學(xué)生物學(xué)體系中突顯獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。本論文主要基于HSFCM的靈敏度,建立一個(gè)能在單細(xì)胞器水平對(duì)線粒體進(jìn)行多參數(shù)分析的平臺(tái)。文中首先利用熒光探針對(duì)線粒體內(nèi)膜、核酸進(jìn)行

3、標(biāo)記,在HSFCM上建立了單個(gè)線粒體的檢測(cè)模式;進(jìn)而采用免疫熒光的方法對(duì)線粒體蛋白進(jìn)行標(biāo)記,利用HSFCM嘗試了單線粒體水平的蛋白檢測(cè);并在此基礎(chǔ)上,利用三通道的HSFCM開(kāi)展了單個(gè)線粒體的多參數(shù)分析,在線粒體水平實(shí)現(xiàn)了對(duì)其純度、結(jié)構(gòu)和功能完整性的全面考察。最后在全面建立的多參數(shù)分析平臺(tái)上,將體系進(jìn)一步推廣至凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè),并初步開(kāi)展了抗腫瘤藥物作用機(jī)理的研究,主要內(nèi)容如下:
　　1.建立以HeLa腫瘤細(xì)胞為模型的線粒體提純方

4、法,采用綠色熒光探針NAO對(duì)線粒體內(nèi)膜上的心磷脂進(jìn)行特異性標(biāo)記,利用HSFCM實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)線粒體的檢測(cè);采用紅色熒光探針SYTO62對(duì)線粒體的核酸進(jìn)行標(biāo)記,嘗試用NAO和SYTO62兩種熒光探針對(duì)線粒體進(jìn)行同時(shí)標(biāo)記,在HSFCM上初步建立了單個(gè)線粒體的檢測(cè)模式(第二章)。
　　2.采用免疫熒光的方法對(duì)線粒體的外膜穿孔蛋白(porin)進(jìn)行標(biāo)記,優(yōu)化線粒體膜蛋白檢測(cè)的染色方案;通過(guò)優(yōu)化免疫熒光的樣品制備如細(xì)胞器的固定、打孔條件等,以

5、位于線粒體內(nèi)膜及膜間隙的細(xì)胞色素c蛋白(cyt c)為模型,建立了適用于線粒體內(nèi)部蛋白的免疫熒光標(biāo)記方法,從而為HSFCM應(yīng)用于單個(gè)線粒體水平的線粒體蛋白檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)(第三章)。
　　3.在已經(jīng)建立的線粒體特異性生化物質(zhì)熒光標(biāo)記、線粒體蛋白免疫熒光標(biāo)記和相應(yīng)檢測(cè)模式基礎(chǔ)之上,將三通道HSFCM應(yīng)用于單個(gè)線粒體的多參數(shù)分析。利用HSFCM檢測(cè)NAO和SYTO62熒光探針同時(shí)標(biāo)記的線粒體,實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)線粒體純度和結(jié)構(gòu)完整性的考察;對(duì)

6、線粒體的porin和cyt c同時(shí)進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記,利用HSFCM實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)線粒體功能完整性的考察;并在線粒體水平考察了Ca2+刺激所引起的細(xì)胞色素c的釋放和線粒體的外膜損傷(第四章)。
　　4.鑒于Bcl-2家族蛋白在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的重要作用,我們利用HSFCM,在線粒體水平對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bax及Bcl-2進(jìn)行了半定量檢測(cè),并以此為基礎(chǔ),初步開(kāi)展了線粒體凋亡通路相關(guān)抗腫瘤藥物如:星形孢菌素、樺木酸等作用機(jī)理的研究(