無標(biāo)記核酸探針的構(gòu)建及其在高靈敏核酸檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、核酸探針作為現(xiàn)代研究生命科學(xué)的一種基本檢測(cè)工具，與一般的檢測(cè)方法相比，具有高靈敏度、強(qiáng)穩(wěn)定性、高特異性、易于合成、設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)?？蒲泄ぷ髡咴谝呀?jīng)研發(fā)出的核酸探針基礎(chǔ)上，不斷開發(fā)出一系列新型核酸探針及其檢測(cè)方法，并廣泛應(yīng)用到生物學(xué)、化學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷以及疾病檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域?；诖?，本論文基于循環(huán)鏈置換擴(kuò)增技術(shù)和核酸外切酶Ⅰ，構(gòu)建了新型無標(biāo)記核酸探針，并應(yīng)用于核酸的高靈敏檢測(cè)，具體開展了以下三個(gè)方面的工作:
　　1、發(fā)展了一種基于聚合酶

2、鏈置換循環(huán)擴(kuò)增的無標(biāo)記長(zhǎng)尾核酸探針體系。在此體系中，核酸探針既可以作為靶分子的識(shí)別探針又可以是聚合酶的反應(yīng)模板，并且結(jié)合具有鏈置換活性的聚合酶，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便，成本低。并且，該體系中無需直接擴(kuò)增目標(biāo)分子，在等溫條件下實(shí)現(xiàn)循環(huán)聚合反應(yīng)，不容易發(fā)生由于外源性污染導(dǎo)致的假陽性反應(yīng)，可以對(duì)核酸進(jìn)行定量檢測(cè)分析。
　　2、發(fā)展了一種基于新型核酸探針介導(dǎo)信號(hào)放大方法用于高靈敏檢測(cè)核酸。新型長(zhǎng)尾核酸探針的長(zhǎng)尾在引物退火延伸過程中延能長(zhǎng)雙鏈D

3、NA產(chǎn)物，嵌入更多的SG熒光染料分子，釋放出強(qiáng)的熒光信號(hào)，與循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)相結(jié)合，提高核酸檢測(cè)的靈敏度，檢測(cè)下限達(dá)到50aM。與分子信標(biāo)探針檢測(cè)方法相比，該方法的優(yōu)勢(shì)在于不用標(biāo)記，且長(zhǎng)尾探針介導(dǎo)的產(chǎn)物能使檢測(cè)信號(hào)放大，進(jìn)一步提高核酸檢測(cè)的靈敏度。
　　3、發(fā)展了一種基于核酸外切酶Ⅰ的新型核酸探針用于超靈敏檢測(cè)DNA或miRNA。核酸外切酶Ⅰ能特異性從3'→5'切割DNA單鏈，當(dāng)沒有靶分子存在時(shí)，其能效地從3'-OH端降解探針和引物，