超高靈敏流式分析技術在單細胞水平細菌耐藥檢測中的應用.pdf

1、近年抗生素濫用導致細菌耐藥日趨嚴重，已對人類健康構成嚴重的威脅。在多種細菌耐藥機制中，細菌產生β-內酰胺酶是80％病原菌耐藥的主要原因，它能水解抗生素的核心結構，使抗生素失效。臨床樣本存在耐藥菌和敏感菌并存的情況，傳統(tǒng)的檢測手段難以檢測少量耐藥菌的存在。因此，發(fā)展快速、靈敏的單細胞水平β-內酰胺類耐藥細菌的檢測手段對于制定有效的臨床治療方案具有重要意義。此外，抗生素的存在對于耐藥菌與敏感菌的生長狀態(tài)的影響也是臨床診治需要考慮的重要因素。

2、流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM）是一種快速的單細胞分析技術，具有靈敏、特異、多參數(shù)同時檢測等優(yōu)點，特別適用于含有少量目標細胞的混合樣本的準確測定。但是，由于細菌粒徑微小、內部結構較為簡單、表達的生物分子拷貝數(shù)較少等原因，傳統(tǒng)的流式細胞儀因靈敏度的限制難以在細菌耐藥研究領域發(fā)揮積極的作用。本實驗室結合瑞利散射和鞘流單分子熒光檢測技術，發(fā)展了超高靈敏流式檢測技術（high sensitivity flow cytometr

3、y，HSFCM），所研制的超高靈敏流式檢測裝置較傳統(tǒng)流式細胞儀靈敏度提高2-3個數(shù)量級，已成功地應用于細菌、線粒體等微納尺度的生化分析體系。本論文將利用HSFCM的高靈敏特性，建立單細胞水平的細菌耐藥檢測方法，為細菌耐藥研究提供先進的檢測平臺。本論文主要由以下五個部分組成:
　　 第一章緒論主要對細菌的作用與危害，抗生素的發(fā)展歷史，抗生素的作用機制，細菌耐藥性的產生機理，細菌耐藥性的獲得與傳播，以及目前耐藥細菌的檢測方法等進行綜

4、述，進而提出本論文的選題思路和研究內容。
　　 第二章針對細菌周質空間β-內酰胺酶的檢測，對實驗條件進行優(yōu)化。我們希望通過對細菌內部β-內酰胺酶的檢測來鑒定細菌是否耐藥。由于β-內酰胺酶位于細菌周質空間內，無論用β-內酰胺酶底物小分子或是β-內酰胺酶單克隆抗體對其進行熒光標記都需要對細菌進行固定、破膜處理。以E.coli JM109/pUC19為耐藥菌模型，以E.coli JM109為敏感菌模型，我們分別優(yōu)化了細菌固定、破膜的實

5、驗條件，使得β-內酰胺酶底物小分子和β-內酰胺酶單克隆抗體能穿越細菌外膜進入周質空間與β-內酰胺酶反應，并利用這兩種熒光標記方法分別在HSFCM上實現(xiàn)了單細胞水平耐藥細菌的檢測。我們所建立的細菌固定、破膜方法也適用于細菌周質空間其它蛋白的檢測。
　　 第三章的內容是建立基于β-內酰胺酶活性的單細胞水平細菌耐藥檢測方法。β-內酰胺酶熒光底物LBRL1被β-內酰胺酶水解后，會釋放出熒光殘基，共價結合在耐藥菌內的蛋白上，我們通過優(yōu)化β

6、-內酰胺酶熒光底物LBRL1的加入濃度與反應時間，在HSFCM上實現(xiàn)了耐藥菌的單細胞水平檢測，成功地應用于混合菌中濃度低于5％的耐藥菌的指認。此外，我們還發(fā)展了快速鑒定β-內酰胺酶抑制劑效用的實驗方法，并在同樣的破膜和染色條件下對表達β-內酰胺酶的革蘭氏陽性菌進行了檢測，實現(xiàn)了β-內酰胺酶表達量的半定量分析。
　　 第四章為基于免疫熒光標記的單細胞水平細菌耐藥檢測方法的建立。我們通過熒光標記的單克隆抗體與核酸染料對細菌進行雙染，

7、利用所建立的檢測平臺，實現(xiàn)了對耐藥菌與敏感菌混合樣品中耐藥菌相對含量的準確測定，即使混合樣品耐藥菌的比例低至0.1％，也能精確檢測，證明了流式檢測技術在微量耐藥菌檢測方面的獨特優(yōu)勢。此外，采用該方法對抗生素存在條件下耐藥菌和敏感菌在培養(yǎng)過程中的動態(tài)變化進行了實時監(jiān)測，將為疾病的抗生素治療提供科學的依據。
　　 第五章為總結與展望。在這一章中，我們對基于超高靈敏流式檢測技術所建立的快速、靈敏的單細胞水平細菌耐藥檢測方法進行了總結，