簡(jiǎn)介:思想的跨越理性的回歸,學(xué)科核心素養(yǎng)的提出及其對(duì)生物學(xué)教學(xué)的可能影響,解凱彬KBXIESINACOM盱眙江蘇20161229,生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)修訂的概況,1、高中生物課程標(biāo)準(zhǔn)與小學(xué)科學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)修訂,,2、小學(xué)科學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)修訂的亮點(diǎn)(1)向下延伸至1、2年級(jí)(2)強(qiáng)調(diào)“少而精”(3)教學(xué)要求關(guān)注學(xué)生的“深入理解”(4)除了物質(zhì)、生命、地球空間技術(shù)外增加了“技工”的內(nèi)容,,3、高中生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)的主要變化(1)提出了“學(xué)科核心素養(yǎng)”(2)課程內(nèi)容“少而精”成為課程理念(3)以概念層級(jí)的形式描述內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)(4)引入了全新的評(píng)價(jià)方式,,聯(lián)系2011年版的義務(wù)教育生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)的變化,不難得出結(jié)論在生物學(xué)領(lǐng)域,小學(xué)初中高中課程內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)的涉及是循序漸進(jìn)和連貫一致的,,可以預(yù)期的是義務(wù)教育生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)即將沿著高中生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)修訂的方向展開(kāi)新的修訂,學(xué)科核心素養(yǎng)的提出是教育思想的一次跨越,關(guān)鍵詞科學(xué)素養(yǎng)核心素養(yǎng)學(xué)科核心素養(yǎng),科學(xué)素養(yǎng)指公眾對(duì)科學(xué)所了解的程度。通常包括對(duì)科學(xué)的本質(zhì)、目標(biāo)和一般局限的認(rèn)識(shí),以及對(duì)更為重要的科學(xué)思想和方法的理解與認(rèn)同??茖W(xué)素養(yǎng)包括三個(gè)維度對(duì)科學(xué)原理和方法的理解(科學(xué)過(guò)程)對(duì)重要科學(xué)術(shù)語(yǔ)和概念的理解(科學(xué)知識(shí))對(duì)科學(xué)技術(shù)的社會(huì)影響的意識(shí)和理解(科技作用),,核心素養(yǎng),生物學(xué)科核心素養(yǎng),1生命觀念“生命觀念”是指對(duì)觀察到的生命現(xiàn)象及相互關(guān)系或特性進(jìn)行解釋后的抽象,是人們經(jīng)過(guò)實(shí)證后的觀點(diǎn),是能夠理解或解釋生物學(xué)相關(guān)事件和現(xiàn)象的意識(shí)、觀念和思想方法。學(xué)生應(yīng)該在較好地理解生物學(xué)概念的基礎(chǔ)上形成生命觀念,如結(jié)構(gòu)與功能觀、進(jìn)化與適應(yīng)觀、穩(wěn)態(tài)與平衡觀、物質(zhì)與能量觀等。能夠用生命觀念認(rèn)識(shí)生物的多樣性和統(tǒng)一性,形成科學(xué)的自然觀和世界觀,指導(dǎo)探究生命活動(dòng)規(guī)律,解決實(shí)際問(wèn)題。,,①以概念建構(gòu)為基礎(chǔ),又高于概念本身②是研究生命科學(xué)的基本思想方法③世界觀在生命科學(xué)領(lǐng)域的體現(xiàn)④對(duì)知識(shí)目標(biāo)提出了更高的要求,2理性思維“理性思維”是指尊重事實(shí)和證據(jù),崇尚嚴(yán)謹(jǐn)和務(wù)實(shí)的求知態(tài)度,運(yùn)用科學(xué)的思維方法認(rèn)識(shí)事物、解決實(shí)際問(wèn)題的思維習(xí)慣和能力。學(xué)生應(yīng)該在學(xué)習(xí)過(guò)程中逐步發(fā)展理性思維,如能夠基于生物學(xué)事實(shí)和證據(jù)運(yùn)用歸納與概括、演繹與推理、模型與建模、批判性思維等方法,探討、闡釋生命現(xiàn)象及規(guī)律,審視或論證生物學(xué)社會(huì)議題。,,①凸顯了生物學(xué)理科屬性②是一種基本習(xí)慣和技能③是從事科學(xué)工作的基本范式④學(xué)會(huì)理性對(duì)待現(xiàn)實(shí)社會(huì)問(wèn)題,3科學(xué)探究“科學(xué)探究”是指能夠發(fā)現(xiàn)現(xiàn)實(shí)世界中的生物學(xué)問(wèn)題,針對(duì)特定的生物學(xué)現(xiàn)象,進(jìn)行觀察、提問(wèn)、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、方案實(shí)施以及結(jié)果的交流與討論的能力。在探究中,樂(lè)于并善于團(tuán)隊(duì)合作,勇于創(chuàng)新。,,①研究生命科學(xué)的基本方法②概念建構(gòu)最直接的方式③公民生存和參與社會(huì)活動(dòng)的重要能力,4社會(huì)責(zé)任“社會(huì)責(zé)任”是指基于生物學(xué)的認(rèn)識(shí),參與個(gè)人與社會(huì)事務(wù)的討論,作出理性解釋和判斷,嘗試解決生產(chǎn)生活問(wèn)題的擔(dān)當(dāng)和能力。學(xué)生應(yīng)能夠以造福人類(lèi)的態(tài)度和價(jià)值觀,積極運(yùn)用生物學(xué)的認(rèn)識(shí)、理解和思想方法,關(guān)注社會(huì)議題,參與討論并作出理性解釋?zhuān)鎰e迷信和偽科學(xué);形成生態(tài)意識(shí),參與環(huán)境保護(hù)實(shí)踐;主動(dòng)向他人宣傳健康生活和關(guān)愛(ài)生命等相關(guān)知識(shí);結(jié)合本地資源開(kāi)展科學(xué)實(shí)踐,嘗試解決現(xiàn)實(shí)生活問(wèn)題。,,①參與個(gè)人與社會(huì)事務(wù)的理性判斷和決策②關(guān)注和解決生產(chǎn)生活的實(shí)際問(wèn)題③形成正確的人生觀(生命觀、生態(tài)觀、生活觀),,學(xué)科核心素養(yǎng)的提出是學(xué)科教學(xué)思想向公民教育思想的一次跨越,從三維目標(biāo)到核心素養(yǎng)的四個(gè)維度的意義并非說(shuō)明三維目標(biāo)是錯(cuò)誤的,而是對(duì)三維目標(biāo)的一種發(fā)展,課程內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)的表述體現(xiàn)出一種理性的回歸,,目前的內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn),,即將公布的內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn),生物學(xué)概念生物學(xué)核心概念(大概念)生物學(xué)重要概念生物學(xué)次位概念,概念的保存時(shí)間,生物學(xué)核心概念(大概念)40年生物學(xué)重要概念40月生物學(xué)次位概念40周,,1、概念教學(xué)的要求提升(概念與知識(shí)的區(qū)別)2、重視構(gòu)建完善的知識(shí)網(wǎng)絡(luò)3、體現(xiàn)了“少而精”的課程理念(學(xué)科化與去學(xué)科化妥協(xié)的結(jié)果)4、改進(jìn)學(xué)習(xí)方式(概念的建構(gòu)是主動(dòng)學(xué)習(xí)的結(jié)果),,強(qiáng)調(diào)概念教學(xué)是對(duì)課程改革的反思,是一種理性的回歸我們的課程改革在基本社會(huì)體制保障不健全的情況下不應(yīng)盲目模仿國(guó)外的所謂先進(jìn)經(jīng)驗(yàn),而放棄我們長(zhǎng)期以來(lái)形成的優(yōu)勢(shì)但是,重走老路是對(duì)這種回歸的極端錯(cuò)誤的理解是歷史的倒退,核心素養(yǎng)的提出對(duì)生物教學(xué)的可能影響,1、更強(qiáng)調(diào)思維品質(zhì)的訓(xùn)練2、課程目標(biāo)的融合3、教與學(xué)方式的改變4、學(xué)習(xí)要求的進(jìn)一步提升,,未來(lái)課堂教學(xué)可能的特點(diǎn)1、知識(shí)的再現(xiàn)遠(yuǎn)不能達(dá)到教學(xué)要求2、自主、合作、探究依然會(huì)是教學(xué)的主題3、概念教學(xué)策略滲透到每一節(jié)課4、重視跨學(xué)科概念的建立5、校本課程開(kāi)發(fā)必將成為熱點(diǎn)6、教師面臨嚴(yán)峻考驗(yàn),,海爾蒙特提出了什么樣的假設(shè)植物體積累的物質(zhì)來(lái)自土壤海爾蒙特實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是什么植物體增重約80KG,土壤重量減少約01KG海爾蒙特的直接結(jié)論是什么植物體積累的物質(zhì)主要不來(lái)自土壤海爾蒙特的推論(間接結(jié)論)是什么植物體積累的物質(zhì)主要來(lái)自水,節(jié)外生枝,假如土壤減少的重量也約為80KG,能不能說(shuō)明植物積累的物質(zhì)主要來(lái)自土壤,這個(gè)問(wèn)題給了我們什么樣的啟示,海爾蒙特實(shí)驗(yàn)忽略了什么為什么,忽略空氣和陽(yáng)光等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響,最初的問(wèn)題回答了嗎,實(shí)驗(yàn)五1804年,瑞士索緒爾實(shí)驗(yàn),植物體內(nèi)積累的物質(zhì)到底來(lái)源于哪里,結(jié)論植物體利用CO2和H2O合成有機(jī)物并放出氧氣。,,思考題,1、請(qǐng)和你的同學(xué)討論交流你對(duì)于人類(lèi)對(duì)光合作用探究歷程的感悟和體會(huì)2、光合作用中產(chǎn)生的有機(jī)物就僅僅是糖類(lèi)嗎(不僅僅回答是否,而且要說(shuō)出理由),,經(jīng)典再現(xiàn),,,結(jié)論,DNA的復(fù)制是“半保留復(fù)制”,DNA復(fù)制的具體過(guò)程又是如何發(fā)生的呢,,請(qǐng)簡(jiǎn)要復(fù)述DNA復(fù)制的過(guò)程解旋復(fù)制(互補(bǔ)配對(duì))盤(pán)旋纏繞DNA復(fù)制需要哪些條件模板、DNA解旋酶、原料、DNA聚合酶、能量等,,,DNA復(fù)制真的這么簡(jiǎn)單嗎,,謝謝,
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簡(jiǎn)介:第19章分子生物學(xué)常用技術(shù)--4學(xué)時(shí)分子雜交、PCR、基因測(cè)序蛋白質(zhì)研究技術(shù)雙向電泳,酵母雙雜交基因轉(zhuǎn)移與基因剔除含RNA干擾第20章基因工程--4學(xué)時(shí)第21章基因診斷與基因治療--4學(xué)時(shí),第四篇分子生物學(xué)技術(shù)與應(yīng)用,,第十九章,分子生物學(xué)常用技術(shù),分子生物學(xué)技術(shù)能幫助我們干什么,揭示生物大分子DNA、RNA、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能DNA水平基因序列分析、拷貝數(shù)和染色體定位RNA水平定量分析、基因表達(dá)產(chǎn)物的可變剪接分析蛋白質(zhì)水平蛋白質(zhì)定量、定位、功能細(xì)胞與整體水平基因在活體中的功能目的了解疾病發(fā)生的規(guī)律,提供治療與預(yù)防手段,我們需要了解和掌握哪些基本技術(shù),基本技術(shù)核酸測(cè)序、印跡、雜交、體外擴(kuò)增技術(shù)蛋白質(zhì)電泳與印跡、組學(xué)技術(shù)、相互作用綜合技術(shù)基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)基因生物與基因敲除技術(shù)應(yīng)用技術(shù)基因診斷基因治療,MOLECULARHYBRIDIZATION利用已知核酸序列探針/PROBE檢測(cè)與其互補(bǔ)的未知核酸序列用途確認(rèn)核酸序列間同源性對(duì)特定核酸序列進(jìn)行定量自核酸混合體中辨認(rèn)特定核酸序列,第一節(jié)核酸分子雜交,一、基本原理,變性DENATURE復(fù)性RENATURE雜交HYBIRIDIZATION,,,核酸變性,在特定變性因素作用下,DNA雙螺旋解離的過(guò)程破壞氫鍵與疏水作用可導(dǎo)致變性熱變性高溫可使核酸變性,溫度高于90℃時(shí)任何核酸雙鏈都將變性酸堿變性PH11時(shí)核酸將變性,DNA使用堿變性,RNA則不可化學(xué)試劑變性能夠破壞氫鍵的化學(xué)試劑如尿素或甲酰胺可使核酸變性,變性溫度,TMMELTINGTEMPERATURE,解鏈溫度或變性溫度影響變性溫度的因素溶液的離子強(qiáng)度變性溫度與離子強(qiáng)度正相關(guān),低鹽利于變性DNA分子的GC含量GC%=TM-693224,核酸復(fù)性,變性的DNA單鏈相互識(shí)別并結(jié)合,恢復(fù)其天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的過(guò)程復(fù)性類(lèi)似與化學(xué)反應(yīng),需要一定反應(yīng)時(shí)間,影響DNA復(fù)性速度的因素,DNA分子的濃度濃度高,復(fù)性快DNA分子的長(zhǎng)度長(zhǎng)片段復(fù)性速度慢DNA分子的復(fù)雜性重復(fù)序列復(fù)性速度快不同物種C0T曲線比較人類(lèi)基因組C0T曲線,二、核酸探針,PROBE用于測(cè)定未知核酸片段的已知序列探針為DNA或RNA,可以為單鏈或雙鏈探針必需經(jīng)過(guò)標(biāo)記放射性標(biāo)記或非放射性標(biāo)記,1探針有哪些種類(lèi),DNA探針常規(guī)探針利用基因組DNA序列或CDNA序列合成的探針,一般為雙鏈,也可制備成單鏈RNA探針高靈敏度探針一般是通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄而來(lái),均為單鏈寡核苷酸探針OLIGONUCLEOTIDE用于點(diǎn)突變檢測(cè)人工合成的短序列20NT,可自由選擇序列,2標(biāo)記物有哪些,標(biāo)記物的要求高度的靈敏性足以檢測(cè)到極微量的核酸序列高度的特異性足以在大量非特異性序列中檢測(cè)到特異的靶序列標(biāo)記物的種類(lèi)放射性同位素RADIOISOTOPE非放射性標(biāo)記物NONRADIOACTIVELABEL,放射性同位素,特點(diǎn)靈敏度最高的標(biāo)記物,足以檢測(cè)到飛克級(jí)微量的核酸序列G→MG→ΜG→NG→PG→FG常用的放射性同位素,放射性標(biāo)記的核苷酸單體,DNTPORNTP5’OR3’P32LABELLING,非放射性標(biāo)記物,特點(diǎn)安全且易于存放,但靈敏度與特異性均不及放射性同位素地高辛通過(guò)地高辛抗體結(jié)合并檢測(cè)生物素結(jié)合親和素/鏈親和素AVIDIN/STREPTAVIDIN化學(xué)發(fā)光物質(zhì)通過(guò)紫外激發(fā)或化學(xué)反應(yīng)而發(fā)光電子密度標(biāo)記物金等重金屬,3如何檢測(cè)雜交信號(hào),同位素標(biāo)記物蓋革計(jì)數(shù)器、液體閃爍計(jì)數(shù)器放射自顯影AUTORADIOGRAPHY,如何檢測(cè)雜交信號(hào),非放射性標(biāo)記物酶聯(lián)免疫技術(shù)ENZYMELINKEDIMMUNOASSAY化學(xué)發(fā)光CHEMILUMINESCENCE,三、如何對(duì)核酸探針進(jìn)行標(biāo)記,1缺口平移,NICKTRANSLATION適用于標(biāo)記雙鏈DNA控制DNASEI的用量,可以控制探針的長(zhǎng)度,2非放探針的酶促標(biāo)記,生物素或地高辛標(biāo)記的核苷酸單體通過(guò)酶促反應(yīng)可以參入探針,3非放探針的化學(xué)標(biāo)記,利用光敏基因經(jīng)可見(jiàn)光照射直接與核酸結(jié)合,四、如何進(jìn)行雜交,樣品DNAORRNA吸附于支持物尼龍膜、硝酸纖維膜、載玻片等與標(biāo)記的探針雜交封閉液封閉后雜交,雜交爐中進(jìn)行緩沖液清洗控制溫度與變性劑濃度顯色放射自顯影/酶聯(lián)顯色,五、雜交有哪些不同的方式,斑點(diǎn)雜交DOTHYBRIDIZATIONSOUTHERN印跡雜交SOUTHERNBLOTNORTHERN印跡雜交NORTHERNBLOTWESTERNBLOTTING不是雜交原位雜交INSITUHYBRIDIZATION反NORTHERN印跡雜交REVERSENORTHERNBLOT基因芯片/DNA微陣列GENECHIP/DNAMICROARRAY,DOTHYBRIDIZATION,將核酸樣品直接點(diǎn)在雜交膜上與探針進(jìn)行雜交特點(diǎn)簡(jiǎn)便但特異性不高可探測(cè)核酸含量,但無(wú)法得知分子大小,SOUTHERNBLOT,EDWINSOUTHERN創(chuàng)立的方法電泳技術(shù)與雜交結(jié)合,可顯示靶DNA序列的長(zhǎng)度可進(jìn)行毛吸管轉(zhuǎn)移、真空轉(zhuǎn)移與電轉(zhuǎn)移,,,電泳,轉(zhuǎn)膜,雜交,NORTHERNBLOT,類(lèi)似于SOUTHERN印跡雜交的方法,用于RNA檢測(cè),INSITUHYBRIDIZATION,原位雜交特定MRNA的組織細(xì)胞分布,FISH,FLUORESCENCEINSITUHYBRIDIZATIONFISH特定基因的染色體定位,反NORTHERN雜交與DNA芯片,反NORTHERN雜交將探針DNA片段固定在雜交膜上,利用標(biāo)記物標(biāo)記的RNA進(jìn)行雜交,第二節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),PCR,POLYMERASECHAINREACTION在體外選擇性擴(kuò)增特定DNA片段的高效手段70年代有人提出PCR的設(shè)想,因缺乏寡核苷酸的合成手段和適合的酶而無(wú)法進(jìn)行1984年KARYMULLIS發(fā)明PCR,并因此獲得1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)全自動(dòng)的熱循環(huán)儀和多種PCR衍生技術(shù)使其成為重要的科學(xué)研究手段,一、PCR的基本原理,在體外,以特定引物引導(dǎo),通過(guò)DNA聚合酶選擇性擴(kuò)增特定區(qū)域變性DENATURE退火ANNEAL延伸EXTENSION,DNA的體內(nèi)復(fù)制,引物酶,引物酶,DNA的體內(nèi)復(fù)制,DNA聚合酶,DNA聚合酶,DNA的體內(nèi)復(fù)制,DNA加熱解鏈,模板DNA,,,,引物1,引物2,引物1,引物2,TAQ酶,TAQ酶,第1輪結(jié)束,第2輪開(kāi)始,72℃,,,,,,,,,,,,TAQ,TAQ,TAQ,,TAQ,55℃,,,,,,,,,,第2輪結(jié)束,模板DNA,第1輪擴(kuò)增,第2輪擴(kuò)增,第3輪擴(kuò)增,第4輪擴(kuò)增,第5輪擴(kuò)增,第6輪擴(kuò)增,理想拷貝數(shù)2NN循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)1XNX平均效率,約為085N循環(huán)次數(shù),,,,,,重復(fù)13步2530輪,目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上,DNA雙螺旋,DNA單鏈與引物復(fù)性,新鏈延伸,,,,,DNA的體外擴(kuò)增,熱循環(huán),DNA解鏈,,PCR反應(yīng)體系4種DNTP混合物各200ΜMOL/L引物各0105ΜMOL/L模板DNA01~2ΜGTAQDNA聚合酶25UMG215MMOL/L,DNA的體外擴(kuò)增,PCR技術(shù)的特點(diǎn),高度的靈敏性理論上經(jīng)20循環(huán)可將目的基因片段擴(kuò)增220=1000000倍高度的特異性利用引物與模板的特異性配對(duì),可保證擴(kuò)增的特異性一對(duì)20堿基長(zhǎng)引物的多樣性為440=1024應(yīng)用的廣泛性目前已經(jīng)成為分子生物學(xué)研究必不可少的手段操作的簡(jiǎn)便性不需要復(fù)雜的設(shè)備和繁瑣的流程,二、做PCR要有什么條件,酶TAQDNA聚合酶模板DNA可以為基因組DNA或CDNA引物人工合成的寡核苷酸片段DNTP聚合反應(yīng)的核苷酸單體緩沖液包含特定的PH、離子強(qiáng)度和MG2反應(yīng)程序變性、退火、延伸組成的循環(huán)儀器DNA熱循環(huán)儀,或稱(chēng)PCR儀,DNA聚合酶催化的聚合反應(yīng),,DNTP,1什么是耐熱DNA聚合酶,早期PCR曾使用DNA聚合酶I在高溫時(shí)發(fā)生變性,每一循環(huán)都需要重新添加酶延伸反應(yīng)溫度為37℃,非特異性太多目前常用TAQDNA聚合酶純化自嗜熱水生菌THERMUSAQUATICUS可耐受95℃高溫,最適反應(yīng)溫度為72℃左右,TAQDNAPOLYMERASE,在7075℃范圍活性最佳,每秒可延伸150NT95℃時(shí)的半衰期為40MIN按變性時(shí)間1MIN計(jì),能滿(mǎn)足30循環(huán)的反應(yīng)TAQ酶具有5’→3’聚合活性和5’→3’外切活性不具備校讀活性,錯(cuò)誤率為210-4左右錯(cuò)誤合成的DNA片段可以作為模板,循環(huán)數(shù)越多,最終擴(kuò)增產(chǎn)物錯(cuò)誤率越高只能用于檢測(cè),不適合基因克隆,有保真性的耐熱DNA聚合酶嗎,PFUDNAPOLYMERASE常用的高保真耐熱DNA聚合酶有5’→3’外切活性錯(cuò)誤率約110-6適應(yīng)于基因克隆,2如何設(shè)計(jì)寡聚核苷酸引物,引物PRIMER是PCR反應(yīng)必備的前提,對(duì)PCR產(chǎn)物類(lèi)型、長(zhǎng)度和反應(yīng)的特異性具有決定作用PCR需要兩條引物,引物決定擴(kuò)增范圍和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度,引物設(shè)計(jì)原則,引物長(zhǎng)度一般為1530核苷酸引物太短影響雜交體的穩(wěn)定和特異性引物太長(zhǎng)隨機(jī)匹配序列增多,特異性反而下降GC含量一般為40%60%應(yīng)充分考慮退火溫度ANNEALINGTEMPERATUREGC含量低,退火溫度低,易出現(xiàn)非特異GC含量高,非特異性結(jié)合也會(huì)增加引物解鏈溫度粗略計(jì)算公式引物的解鏈溫度TM=4G+C+2A+T,引物設(shè)計(jì)原則,引物自身不應(yīng)該存在鏈內(nèi)互補(bǔ)序列,以防止出現(xiàn)發(fā)卡結(jié)構(gòu),兩條引物間、同一引物的分子間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列出現(xiàn)互補(bǔ)易導(dǎo)致引物二聚體的出現(xiàn),影響擴(kuò)增效率,引物設(shè)計(jì)原則,避免引物與非特異序列間的同源性引物的3,末端必須與模板完全互補(bǔ),5,末端允許添加非配對(duì)序列5,末端允許添加非匹配序列,如酶切位點(diǎn),5’,3’,3如何選擇DNTP和緩沖液,DNTP是聚合反應(yīng)的底物常規(guī)使用濃度02MMEACH探針標(biāo)記時(shí),可使用同位素或非放標(biāo)記的DNTP緩沖液特定的PH和離子強(qiáng)度MG2+濃度一般為15MMPCRMIX預(yù)制的便捷反應(yīng)體系,4用什么做模板DNA,PCR的模板TEMPLATE可以是基因組DNA或CDNA逆轉(zhuǎn)錄PCRREVERSETRANSCRIPTIONPCRRTPCR在利用DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)純化比較簡(jiǎn)單血液、病原體、體外培養(yǎng)細(xì)胞、甚至病理標(biāo)本經(jīng)簡(jiǎn)單處理后均可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增RNA樣品一般要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格純化,并逆轉(zhuǎn)錄未經(jīng)純化的RNA不穩(wěn)定,無(wú)法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中如存在DNA,將對(duì)RNA擴(kuò)增產(chǎn)生干擾,6如何設(shè)計(jì)反應(yīng)程序,PCR的循環(huán)數(shù)理論上2025即可滿(mǎn)足擴(kuò)增需要,但實(shí)際循環(huán)數(shù)一般為2535過(guò)多循環(huán)后到達(dá)平臺(tái)期,繼續(xù)延長(zhǎng)循環(huán)數(shù)無(wú)效,模板濃度高時(shí)平臺(tái)期出現(xiàn)早,模板濃度低時(shí)平臺(tái)期出現(xiàn)晚,應(yīng)根據(jù)模板濃度調(diào)節(jié)循環(huán)數(shù),反應(yīng)程序的關(guān)鍵是退火溫度,退火溫度提高退火溫度有助于提高反應(yīng)的特異性退火溫度過(guò)高將導(dǎo)致引物與模板無(wú)法配對(duì),影響擴(kuò)增效率反應(yīng)的退火溫度主要取決于引物序列,三、我們能用PCR做什么,自PCR技術(shù)創(chuàng)立以來(lái),經(jīng)近20年的發(fā)展,在基本PCR技術(shù)基礎(chǔ)上產(chǎn)生了多種PCR的衍生技術(shù),應(yīng)用于各種不同的目的基因克隆或亞克?。蚬こ烫囟ɑ虮磉_(dá)量的分析基因突變的檢測(cè)--基因診斷病原體特征性序列的鑒定--基因診斷定點(diǎn)誘變--第4節(jié)DNA序列測(cè)定--第3節(jié),最常用的PCR是RTPCR,RTPCRREVERSETRANSCRIPTIONPCR以MRNA為模板先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,再進(jìn)行PCR為什么要以MRNA為模板MRNA無(wú)內(nèi)含子,克隆的基因可在原核表達(dá)MRNA的量代表了基因的表達(dá)水平,如何利用RTPCR檢測(cè)基因表達(dá)水平,定量PCRQUANTITATIVEPCRPCR產(chǎn)物的量與起始的模板量有關(guān)利用PCR對(duì)模板DNA或CDNA進(jìn)行定量測(cè)定定量PCR一般用于特定基因MRNA水平的檢測(cè)RTPCR可用于基因表達(dá)水平檢測(cè)需設(shè)定內(nèi)部參照物REFERENCEGENE,如GAPDH、ACTIN、18SRRNA等穩(wěn)定表達(dá)基因定量是相對(duì)的,一般是不準(zhǔn)確的,為什么說(shuō)RTPCR定量是不準(zhǔn)確的,指數(shù)擴(kuò)增期,產(chǎn)物量與模板量成正比進(jìn)入平臺(tái)期,產(chǎn)物量不能再反應(yīng)模板量不同樣品進(jìn)入平臺(tái)期的循環(huán)數(shù)不同,難以選擇測(cè)定的時(shí)間節(jié)點(diǎn),有精確定量方法嗎,實(shí)時(shí)熒光定量PCRREALTIMEPCR以產(chǎn)物量到達(dá)一定閾值所需要的循環(huán)數(shù)為定量標(biāo)準(zhǔn)需要對(duì)PCR產(chǎn)物的生成量進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)控,,如何進(jìn)行產(chǎn)物量的實(shí)時(shí)檢測(cè),需要熒光標(biāo)記探針與兩側(cè)PCR引物探針標(biāo)記有報(bào)告熒光與粹滅熒光反應(yīng)過(guò)程中探針被降解,報(bào)告熒光顯色可通過(guò)熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控,巢式PCR可以提高擴(kuò)增效率和特異性,NESTEDPRIMERPCR內(nèi)外兩套引物分兩輪進(jìn)行擴(kuò)增在克隆一些低豐度基因時(shí)可以采用,經(jīng)過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增,具有更高的靈敏度四條引物均與模板匹配,因此增加了特異性,可以利用多對(duì)引物進(jìn)行多重PCR,多重PCRMULTIPRIMERPCR多組引物同時(shí)進(jìn)行的PCR,可大幅度降低PCR反應(yīng)的工作量,可以在組織切片上進(jìn)行原位PCR,原位PCRINSITUPCR在組織切片或細(xì)胞涂片上進(jìn)行的PCR方法主要用于特定基因表達(dá)水平的原位分析組織切片經(jīng)過(guò)固定、蛋白酶和DNASE消化后進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增,SEQUENCING基因結(jié)構(gòu)分析的最基本方法主要方式化學(xué)降解法酶法SANGER法/雙脫氧鏈末端終止法二代/三代測(cè)序技術(shù),第三節(jié)基因測(cè)序,適用于寡核苷酸片段測(cè)序的方法基本反應(yīng)GDMSG/A哌啶T/C肼低鹽C肼高鹽,一、化學(xué)降解法,SANGER在1977年建立的方法,也稱(chēng)酶法測(cè)序DNA序列測(cè)定的最常用方法,二、雙脫氧末端終止法,在反應(yīng)體系中加入2’,3’DDNTP,由于其沒(méi)有3’OH而不能與下一個(gè)核苷酸相連,于是DNA鏈的合成便終止。,SANGER法測(cè)序,模板單鏈→單雙鏈均可酶KLENOW→耐熱DNA聚合酶標(biāo)記同位素標(biāo)記→熒光標(biāo)記電泳平板電泳→毛細(xì)管電泳4泳道→單一泳道,酶法測(cè)序的自動(dòng)化程度越來(lái)越高,二代測(cè)序技術(shù)NEXTGENERATIONSEQUENCING1天完成全基因組測(cè)序羅氏、SOLEXA、ABI等公司各有不同技術(shù)利用微珠或芯片實(shí)現(xiàn)大通量,邊合成邊測(cè)序三代測(cè)序技術(shù)NEXTNEXTGENERATIONSEQUENCING3分鐘完成全基因組測(cè)序基于納米微孔的單分子測(cè)序技術(shù),二代測(cè)序與三代測(cè)序技術(shù),第四節(jié)DNA定點(diǎn)誘變技術(shù)自學(xué)),目前主要用PCR方法進(jìn)行定點(diǎn)誘變也可進(jìn)行突變基于的全合成,第五節(jié)RNA干擾技術(shù),學(xué)習(xí)基因工程之后,在基因剔除技術(shù)部分介紹,第六節(jié)生物芯片,生物芯片BIOCHIP基于微電子技術(shù)和生物信息技術(shù)建立的高度集成化的生物樣本分析方法生物芯片是后基因組時(shí)代的利器生物芯片有哪些種類(lèi)DNAMICROARRAYPROTEINMICROARRAYANTIBODYMICROARRAYCHEMICALCOMPOUNDMICROARRAYTISSUEMICROARRAY,什么是基因芯片技術(shù),基因芯片GENECHIP,一種高通量的核酸雜交方法,又稱(chēng)DNA微陣列DNAMICROARRAY將大量探針固定與固相支持物,與標(biāo)記的待測(cè)樣品進(jìn)行雜交的方法AFFYMETRIX公司已經(jīng)將GENECHIP注冊(cè),如何制作基因芯片,CDNA芯片CDNA片段以顯微打印的方式固定于固相支持物表面,集成度較低原位合成芯片以激光蝕刻技術(shù)直接合成寡核苷酸探針,集成度可達(dá)105點(diǎn)陣/CM2以上,基因芯片能幫助我們干什么,基因表達(dá)譜芯片GENEEXPRESSIONPROFILE基因表達(dá)的大通量分析SNP芯片SINGLENUCLEOTIDEPOLYMORPHISM單核苷酸多態(tài)性的大通量檢測(cè)微小RNA芯片MIRNA分析MICRORNA甲基化芯片分析基因組甲基化狀態(tài)CHIPCHIPCHROMATINIMMUNOPRECIPITATION分析DNA與蛋白質(zhì)的相互作用,芯片的主要工作流程,選擇與購(gòu)買(mǎi)芯片準(zhǔn)備樣品標(biāo)記樣品雜交檢測(cè)雜交信號(hào)分析處理結(jié)果,第七/八節(jié)蛋白質(zhì)分析方法,蛋白質(zhì)的定量分析ELISAENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAYWESTERNBLOT蛋白質(zhì)的定位免疫組織化學(xué)熒光蛋白的活細(xì)胞定位蛋白質(zhì)相互作用的研究蛋白質(zhì)功能的研究蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),PROTEOMICS,蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)特定組織細(xì)胞總蛋白的整體性研究,蛋白質(zhì)組學(xué)研究的目的什么,解讀基因組基因組編碼了多少基因蛋白表達(dá)比研究RNA表達(dá)深入了一步蛋白功能超過(guò)1/3的蛋白質(zhì)功能不明確蛋白質(zhì)修飾糖基化、磷酸化、酶解等蛋白質(zhì)定位SUBPROTEOME蛋白蛋白相互作用互作是功能的基礎(chǔ),蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)是什么,1975年,雙向電泳技術(shù)建立1990年,更新的EDMAN降解法用于微量蛋白質(zhì)測(cè)序,靈敏度達(dá)到PMOL級(jí)質(zhì)譜技術(shù)使蛋白測(cè)序靈敏度達(dá)到FMOL級(jí)基因組計(jì)劃提供了大量的生物信息雙向電泳+質(zhì)譜+生物信息分析,等電聚焦+SDSPAGE,雙向電泳技術(shù),雙向電泳,等電聚焦+SDSPAGE,雙向電泳的優(yōu)點(diǎn)與缺陷,優(yōu)點(diǎn)比單向電泳有更高的分辨率缺點(diǎn)與解決辦法無(wú)法檢測(cè)低豐度蛋白分組檢測(cè)無(wú)法檢測(cè)大分子量或脂溶性蛋白酶解電泳圖譜解讀困難自動(dòng)化分析、DIGE,DIFFERENCEGELELECTROPHORESISDIGE,MASSSPECTROMETRY,肽質(zhì)譜MS分析混合多肽只能確定氨基酸組成,不能分析序列氨基酸質(zhì)譜分析單一肽的氨基酸序列串聯(lián)質(zhì)譜TANDEMMASSSPECTROMETRY,MS/MS可以分析氨基酸序列通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)比較確認(rèn)肽的來(lái)源,MS與MS/MS,如何進(jìn)行蛋白蛋白相互作用的分析,酵母雙雜交YEASTTWOHYBRIDIZATION噬菌體展示文庫(kù)PHAGEDISPLAYLIBRARY免疫共沉淀COIMMUNOPRECIPITATIONFRETFLUORESCENCERESONANCEENERGYTRANSFER,YEASTTWOHYBRIDIZATION,蛋白質(zhì)相互作用的篩查方法以特定蛋白為釣餌,篩選其相互作用蛋白,如何利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行功能分析,蛋白質(zhì)芯片抗原-抗體鑒定蛋白質(zhì)相互作用鑒定蛋白質(zhì)與小分子相互作用代謝組學(xué)檢測(cè)酶活性蛋白質(zhì)功能的高通量分析,本章的主要內(nèi)容是什么,通過(guò)本章學(xué)習(xí)了解了哪些核酸和蛋白質(zhì)研究方法什么是分子雜交分子雜交的探針是什么怎樣進(jìn)行標(biāo)記分子雜交有哪些基本方式什么是PCR基本原理是什么PCR反應(yīng)體系是由什么組成的,本章的主要內(nèi)容是什么,什么是RTPCR能用來(lái)干什么如何利用PCR進(jìn)行核酸的定量分析什么是基因芯片什么是蛋白質(zhì)組學(xué)核心方法是什么如何進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用的研究,
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上傳時(shí)間:2024-01-05
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