版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)
文檔簡介
1、延遲整流鉀電流(IK)是哺乳動物和人的心室肌細胞動作電位復(fù)極主要的外向鉀電流,按照通道動力學(xué)特征將IK區(qū)分為快激活(IKr)和緩慢激活I(lǐng)Ks)兩種成分。其中,IKs通道的孔區(qū)α-亞單位由KCNQ1基因編碼、β-亞單位由KCNE1基因編碼。現(xiàn)已明確,先天性KCNQ1和KCNE1基因突變可致IKs增大或減小,分別引發(fā)長QT綜合征(LQT)和短QT綜合征(SQT)。心臟疾病如心肌缺血、心肌肥厚、慢性心力衰竭等均伴隨IKs的減小,表現(xiàn)為獲得性L
2、QT。LQT和SQT均以高發(fā)室性心律失常為特征。因此,研究KCNQ1/KCNE1通道的功能調(diào)節(jié)具有重要意義。
越來越多的證據(jù)表明,催化磷酸化反應(yīng)的蛋白磷酸激酶C(PKC)家族與KCNQ1/KCNE1通道的功能調(diào)控相關(guān),但迄今關(guān)于PKC對IKs的調(diào)節(jié)報道不盡相同,有增加和減小兩種相反的結(jié)果。已知PKC家族按照結(jié)構(gòu)和激活方式的不同可以分為傳統(tǒng)型PKC(cPKC,包括α、βI、βII和γ),新型PKC(nPKC,包括δ、ε、π和θ)
3、和非典型PKC(aPKC,包括ζ、ι/λ)三大類,而不同動物種屬的心肌組織均存在PKCα、βI、βII、θ、δ、γ等亞型。很可能上述PKC對IKs的不同調(diào)節(jié)現(xiàn)象是因為激活的PKC亞型不同所致。離子通道電流的大小取決于通道孔的通透性、開放概率以及細胞膜上通道數(shù)量,調(diào)節(jié)后者的因素涉及基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、轉(zhuǎn)運以及降解等環(huán)節(jié)。其中蛋白的正向轉(zhuǎn)運與降解平衡是決定細胞膜上通道數(shù)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié),目前,不同PKC亞型如何調(diào)控細胞膜通道蛋白轉(zhuǎn)運與降解從而影
4、響細胞膜上通道數(shù)量尚不清楚。
因此,本研究主要在分子生物學(xué)水平,利用非選擇性PKC激動劑和連接透膜序列的選擇性PKC激動肽,在異源表達系統(tǒng)上研究不同PKC亞型對細胞膜上KCNQ1表達水平的調(diào)節(jié)作用,并且探究其調(diào)節(jié)作用的機制。這對理解心肌離子通道的病理重構(gòu)機制具重要意義,也將為發(fā)現(xiàn)以PKC亞型為靶點的新型抗心律失常藥物提供重要的理論依據(jù)。
第一部分不同PKC亞型對KCNQ1蛋白表達調(diào)節(jié)作用。
目的:在構(gòu)建的穩(wěn)
5、定表達KCNQ1/KCNE1通道的HEK293細胞系上,研究不同PKC亞型對KCNQ1總蛋白、細胞膜蛋白表達水平的影響。
方法:
1.全細胞蛋白提?。杭毎春筝p輕刮下并離心,收集細胞沉淀,按照RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑(PMSF)以100:1的比例加入并使細胞沉淀充分混懸,冰上超聲破碎后靜置裂解,離心收集上清液。
2.細胞膜蛋白提取:利用生物素?;姆椒擞浖毎さ鞍祝浞至呀馄扑榧毎?,借助珠子特異性
6、結(jié)合的方式將生物素標記的膜蛋白分離,其余成份離心丟棄,再經(jīng)洗脫,得到純凈的細胞膜蛋白成份。
3.Western blot:對提取的全細胞蛋白或者細胞膜蛋白進行SDS-PAGE電泳,經(jīng)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用TBST配制含10%脫脂奶粉的封閉液進行封閉,通過特異性的一抗與紅外熒光標記的二抗結(jié)合,用ODYSSEY雙色紅外激光成像系統(tǒng)儀器進行曝光成像。
4.siRNA瞬時轉(zhuǎn)染:采用Lipofectin RNAmax試劑
7、盒進行瞬時轉(zhuǎn)染,鋪板后24小時,細胞匯合度達到50%-60%時可進行siRNA的瞬時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染4小時左右后換完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后,siRNA表達完成,可進行下一步處理。
結(jié)果:
1.不同PKC亞型對全細胞KCNQ1蛋白表達水平的影響:利用非選擇性PKC激動劑PMA(100 nM)、OAG(10μM)和選擇性cPKC激動肽(200 nM)、PKCε激動肽(200 nM)分別孵育24小時,Western blo
8、t檢測全細胞KCNQ1蛋白表達沒有明顯變化。
2.不同PKC亞型對細胞膜KCNQ1蛋白表達水平的影響:首先,驗證細胞膜蛋白提取方法的敏感性。采用陽性對照藥地塞米松(50 nM)(已被證實通過抑制蛋白泛素化降解,顯著增加細胞膜KCNQ1蛋白表達水平)孵育6、24小時后,與對照組相比,細胞膜KCNQ1蛋白表達水平分別是對照的176%和281%,證明實驗所用的細胞膜蛋白提取方法敏感性較好。
PMA、OAG以及cPKC激動肽
9、、PKCε激動肽分別與細胞孵育6、24小時,Western blot檢測細胞膜KCNQ1蛋白表達水平。結(jié)果顯示,PMA孵育后細胞膜KCNQ1蛋白表達水平分別是對照的36%和24%;cPKC激動肽孵育后,細胞膜KCNQ1蛋白表達水平分別是對照的24%和30%;PKCε激動肽孵育后細胞膜KCNQ1蛋白表達水平是對照的34%和34%;而OAG孵育后,細胞膜KCNQ1蛋白表達水平?jīng)]有明顯變化。
3.siRNA敲低不同PKC亞型對激動肽
10、作用的影響:利用siRNA干擾技術(shù),敲低不同PKC亞型表達,觀察對上述PKC亞型激動肽作用的影響,進一步驗證其作用的特異性。結(jié)果顯示,敲低細胞PKC和β亞型可逆轉(zhuǎn)cPKC激動肽下調(diào)細胞膜KCNQ1蛋白表達的作用,未敲低為對照的48%,而敲低PKC和β亞型后為對照的94%。與此相似,敲低PKCε亞型后PKCε激動肽對細胞膜KCNQ1蛋白表達的下調(diào)作用顯著減弱,未敲低為對照的33%,而敲低PKCε亞型后為對照的68%。因此,實驗進一步表明P
11、KC亞型特異性調(diào)節(jié)細胞膜KCNQ1蛋白表達的作用。
小結(jié):在異源表達系統(tǒng)上, PMA、cPKC和PKCε激動肽對全細胞KCNQ1蛋白表達無明顯影響,而對細胞膜KCNQ1蛋白表達均呈現(xiàn)明顯下調(diào)作用,提示PKC通過調(diào)節(jié)通道的轉(zhuǎn)運與降解過程影響細胞膜上的通道表達水平。
第二部分不同PKC亞型對細胞膜KCNQ1表達調(diào)節(jié)作用的機制
目的:探究激活cPKC亞型和PKCε亞型后下調(diào)細胞膜KCNQ1蛋白表達的調(diào)節(jié)作用機制。
12、
方法:觀察選擇性干擾細胞膜通道蛋白內(nèi)吞、降解和正向轉(zhuǎn)運過程的工具藥對PKC亞型激動肽作用的影響,分析激活不同PKC亞型對上述過程的調(diào)節(jié)作用。細胞膜蛋白提取和Western blot方法同第一部分。
結(jié)果:
1.對細胞膜蛋白內(nèi)吞過程影響:觀察內(nèi)吞抑制劑Dynasore(80μM)對激活不同PKC亞型作用的影響。結(jié)果顯示,PMA與Dynasore共同孵育6小時后對細胞膜KCNQ1蛋白表達的下調(diào)作用被明顯抑制,
13、單獨孵育表達水平為對照的34%,而共同孵育為對照的89%;與此相似,cPKC激動肽與Dynasore共同孵育對細胞膜KCNQ1蛋白表達的下調(diào)作用同樣被明顯抑制,單獨孵育表達水平為對照的24%,而共同孵育為對照的89%。上述結(jié)果表明PMA和cPKC激動肽通過促進馬達蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑使細胞膜KCNQ1蛋白加速降解而發(fā)揮下調(diào)作用。與此相反,PKCε激動肽與Dynasore共同孵育對KCNQ1細胞膜蛋白表達的下調(diào)作用未受影響,單獨孵育表達水平
14、為對照的29%,而共同孵育表達水平為對照的39%,提示PKCε激動肽并非通過影響內(nèi)吞過程減少細胞膜KCNQ1表達水平。此外,單獨孵育Dynasore并不明顯改變細胞膜KCNQ1蛋白表達水平,可能是其他代償?shù)姆绞綇浹a了馬達蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑阻斷所帶來的影響。
2.對細胞膜蛋白降解的影響:加入正向轉(zhuǎn)運阻斷劑Brefeldin A(BFA)(10μM)后利用Western blot檢測不同時間細胞膜上KCNQ1蛋白表達水平,可以反映
15、出通道細胞膜蛋白降解速度。結(jié)果顯示,以各自0小時細胞膜KCNQ1蛋白表達水平為100%,BFA對照組孵育6、24小時分別是0小時的72%和39%,cPKC激動肽共孵育分別是30%和14%,與對照相比降解顯著增多;而PKCε激動肽共孵育分別是68%和33%,降解程度與對照相比無明顯差別。結(jié)果進一步驗證了激活cPKC亞型通過加速內(nèi)吞降解過程下調(diào)細胞膜KCNQ1蛋白表達水平,而激活PKCε亞型對細胞膜KCNQ1蛋白表達的下調(diào)作用則可能是通過抑
16、制蛋白正向轉(zhuǎn)運或者再循環(huán)過程而實現(xiàn)的。與此類似,也觀察了PMA對蛋白降解的影響。結(jié)果顯示,BFA對照組孵育后細胞膜KCNQ1蛋白表達水平分別是0小時的82%和32%,而PMA共孵育分別是45%和14%,兩個時間點的降解程度均顯著高于對照,表明PMA也通過加速內(nèi)吞降解過程來下調(diào)細胞膜KCNQ1蛋白表達水平。結(jié)果提示盡管PMA為非選擇性PKC激動劑,但其作用機制與cPKC亞型相似,可能在此實驗系統(tǒng)PMA主要通過激活cPKC亞型下調(diào)細胞膜KC
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- KCNQ1通道突變致病機制及乙醇作用的研究.pdf
- KCNQ1突變基因?qū)е?LQTS的新機制研究及乙醇對 KCNQ1通道的影響.pdf
- 乙醇與kcnq1通道相互作用以及蛋白激酶對kv4.3通道門控調(diào)節(jié)的研究
- 不同PKC亞型對hERG鉀通道蛋白表達的影響.pdf
- KCNE1不同結(jié)構(gòu)域與KCNQ1通道相互作用的功能研究.pdf
- PKC對心房顫動患者心房肌細胞SK2通道的調(diào)節(jié)作用及機制研究.pdf
- BK通道α與β2亞基結(jié)合位點以及KCNE2調(diào)節(jié)KCNQ1通道上膜機制的研究.pdf
- 血管緊張素Ⅱ?qū)CNQ1-KCNE1鉀通道蛋白表達的調(diào)節(jié).pdf
- C57BL-6J小鼠耳蝸KCNQ1和NKCC1通道蛋白的年齡相關(guān)性表達及其與聽力的關(guān)系.pdf
- TRPV1和TRPV4通道對小鼠肺血管張力的調(diào)節(jié)作用.pdf
- 嗎啡對酸敏感離子通道功能與表達的調(diào)節(jié)作用及機制.pdf
- H+對熱敏感TRPV3通道電流的調(diào)節(jié)作用研究.pdf
- WNK1激酶對鈣激活鉀通道的調(diào)節(jié)作用及機制研究.pdf
- 氧化還原對心肌L型鈣通道的調(diào)節(jié)作用及作用機制.pdf
- 白術(shù)內(nèi)酯I對慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸水通道蛋白3、4表達的調(diào)節(jié)作用和機制.pdf
- kir2.3通道功能調(diào)節(jié)機制的研究
- 57086.pkc及其α亞類對haras基因表達調(diào)節(jié)作用之初探
- Sigma-1受體對N型鈣通道的負性調(diào)節(jié)作用及其機制研究.pdf
- 高糖、PKC對原代培養(yǎng)的腹膜間皮細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1調(diào)節(jié)作用的研究.pdf
- 蛋白激酶C-α對水通道蛋白2轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)作用研究.pdf
評論
0/150
提交評論