Sigma-1受體對N型鈣通道的負性調(diào)節(jié)作用及其機制研究.pdf

1、Sigma受體是具有伴侶蛋白活性的一類受體蛋白。鑒于其與其他哺乳動物蛋白沒有同源性以及與其他受體相比所具有的獨特的生理功能，現(xiàn)在也被認為是一類孤兒受體。目前認為Sigma受體家族包括兩個亞型，一個亞型為Sigma-1受體，另一個亞型為Sigma-2受體。由于到現(xiàn)在為止，還未獲得Sigma-2受體的克隆，也不清楚其氨基酸序列和結構，所以對它的研究比較少也比較滯后，研究重點一般集中在Sigma-1受體。Sigma-1受體主要聚集于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

2、，并廣泛分布在MAM膜、細胞膜以及核膜等細胞膜系統(tǒng)上。經(jīng)過研究人員對該受體將近40年的研究，尤其在獲得Sigma-1受體的克隆及Sigma-1受體敲除鼠后，我們對其在結構和功能上的認識越來越清晰。Sigma-1受體是包含223個氨基酸的一條蛋白質(zhì)單鏈，其分子量大小約為26 kDa。之前大多數(shù)研究認為Sigma-1受體包括兩個跨膜結構域，且N端和C端均位于膜內(nèi)側。而在2016年，對人源Sigma-1受體的晶體結構解析結果表明，Sigma-

3、1受體是以寡聚體(一般是三聚體)形式存在的一類單次跨膜蛋白，其 N端在膜外，C端則位于膜內(nèi)側。在其功能方面，Sigma-1受體在體內(nèi)發(fā)揮著眾多的生理功能，參與許多疾病的調(diào)控，如記憶損傷、癌癥、心臟疾病、中風、抑郁、阿爾茲海默癥、精神分裂等疾病。Sigma-1受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達最豐富，其功能也最為復雜。通過電生理學及行為藥理學研究表明該受體參與包括抑郁、焦慮、精神分裂、學習記憶、成癮以及疼痛在內(nèi)的中樞疾病的發(fā)生發(fā)展過程。對以上疾病或

4、病理過程進行成因分析，發(fā)現(xiàn)這些疾病的形成和發(fā)展均與相應的神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和傳導緊密相關。通過文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，Sigma-1受體對多巴胺能、谷氨酸能、5-羥色胺能、腎上腺素能、γ-氨基丁酸能和膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和傳導都可產(chǎn)生或增強或抑制的調(diào)節(jié)作用，但是產(chǎn)生該調(diào)節(jié)作用的分子機制目前并未被完全闡明。根據(jù)文獻調(diào)研結果，N型鈣離子通道的開放可引起神經(jīng)遞質(zhì)的釋放并可直接調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞和突觸的輸出，在控制中樞內(nèi)大部分神經(jīng)遞質(zhì)釋放和傳導的過程中均有重

5、要作用。根據(jù)目前的研究進展，我們得知Sigma-1受體可以與許多電壓依賴或配體依賴的離子通道(包括鉀離子通道、鈉離子通道和酸敏感型離子通道等)發(fā)生相互作用，通過影響離子通道的電生理特性進而產(chǎn)生相應的生理效應。所以，我們推測Sigma-1受體是否通過調(diào)節(jié) N型鈣通道進而影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和傳導。但是，通過查閱文獻，我們發(fā)現(xiàn)關于Sigma-1受體與N型鈣通道之間的關系，目前還沒有文獻報道。即，目前為止我們還并不清楚Sigma-1受體能否通過

6、影響N型鈣通道的開放或關閉而影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。
　　為探索Sigma-1受體對神經(jīng)遞質(zhì)的釋放的影響，我們選擇 N型鈣通道作為我們研究的切入點,故本實驗旨在探討Sigma-1受體對N型鈣通道的調(diào)節(jié)作用。結合大膽堿能神經(jīng)元(ChIs)是唯一可以合成并釋放乙酰膽堿的神經(jīng)元，本研究首次利用scRT-PCR以及免疫熒光的方法證明了Sigma-1受體在ChIs上有表達，并通過scRT-PCR實驗證實了ChIs上主要表達N型鈣離子通道，表明C

7、hIs可以作為我們理想的研究模型。利用腦片膜片鉗方法發(fā)現(xiàn)Sigma-1受體對ChIs上的鈣通道存在抑制作用。為了進一步研究Sigma-1受體單獨對 N型鈣通道的作用，選用對研究離子通道具有明顯優(yōu)勢的爪蟾卵母細胞作為研究對象，發(fā)現(xiàn)Sigma-1受體可以同時以配體依賴以及配體非依賴的方式對N型鈣通道產(chǎn)生抑制作用。運用熒光共振能量轉移(FRET)實驗和免疫共沉淀(CO-IP)實驗得知，Sigma-1受體與N型鈣通道之間存在直接相互作用，在 H

8、EK-293T細胞中可以形成蛋白復合體。
　　綜上，本文利用腦片膜片鉗方法、雙電極電壓鉗技術以及分子生物學研究方法，闡明了 Sigma-1受體對N型鈣通道的作用以及作用方式，并為進一步研究Sigma-1受體、N型鈣通道以及神經(jīng)遞質(zhì)三者之間的關系提供了相應的研究基礎和線索。具體結果如下：
　　1、根據(jù)已有文獻，紋狀體的大膽堿能神經(jīng)元(Cholinergic Interneurons,ChIs)上主要表達三種類型的鈣離子通道，即

9、：N型鈣離子通道、P/Q型鈣離子通道和L型鈣離子通道。其中N型鈣離子通道的表達豐度最高。為了驗證這一結論，我們采用單細胞 RT-PCR技術(single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,scRT-PCR)方法在38個ChIs上進行實驗，結果表明在轉錄水平，92.1％的神經(jīng)元上有N型鈣通道的轉錄，78.9%的神經(jīng)元上有P/Q型鈣通道的轉錄，28.9%的神經(jīng)元上有L型

10、鈣通道的轉錄。該實驗結果與文獻報道一致，提示我們可以選用ChIs作為我們的研究對象。
　　2、結合ChIs在調(diào)控乙酰膽堿的釋放中的作用，我們選擇ChIs作為研究對象。首先需要驗證Sigma-1受體在ChIs上是否有表達。通過在30個ChIs上進行scRT-PCR,Sigma-1受體在ChIs上均有轉錄。進一步通過連續(xù)切片免疫熒光實驗，發(fā)現(xiàn)在蛋白水平上Sigma-1受體在ChIs上也有表達。通過scRT-PCR以及免疫熒光的方法，我

11、們首次證明Sigma-1受體在ChIs上有表達，這也成為我們研究Sigma-1受體在ChIs上對N型鈣通道作用的基礎。
　　3、運用電生理方法，在腦片背側紋狀體的ChIs上，我們記錄到鈣離子電流。向記錄液中加入500 nM的N型鈣通道特異性阻斷劑ω--芋螺毒素-GVIA，鈣離子電流被抑制到原電流幅度的27.7%±16.0%，表明N型鈣電流在所記錄的鈣電流中占比達72.3%(n=3, P<0.05）。為觀察Sigma-1受體是否對N

12、型鈣通道有調(diào)節(jié)作用。我們選用 Sigma-1受體的選擇性激動劑 SKF-10047，將不同濃度的該激動劑加入到正常記錄外液中，得到其對鈣電流相應的抑制作用。50μM的SKF-10047抑制鈣電流至原電流的61.3%±7.1%(n=11,P<0.05)，25μM和12.5μM的SKF-10047分別抑制鈣電流幅度為原電流的71.6%±4.9%(n=9,P<0.05)和106.9%±18.2%(n=4,P>0.05)。此外，為進一步驗證Si

13、gma-1受體激動劑的抑制作用，我們選用另外一種激動劑Pre-084,50μM Pre-084可以抑制ChIs的鈣電流至原電流幅度的72.9%±6.4%(n=7, P<0.05)。由此可知，Sigma-1受體激動劑對ChIs上的鈣電流有抑制作用。為證實該抑制作用是通過Sigma-1受體介導的，我們給以Sigma-1受體拮抗劑BD-1063100μM,與50μM SKF-10047聯(lián)合使用加入至記錄液后發(fā)現(xiàn)，鈣電流幅度為原電流的90.0%

14、±5.1%（n=5,P>0.05）。結果表明，Sigma-1受體激動劑對ChIs鈣電流的抑制作用是通過Sigma-1受體介導的，而這些鈣電流中包括N-型鈣電流。
　　4、鑒于爪蟾卵母細胞在研究離子通道上的優(yōu)勢，為方便進一步研究 Sigma-1受體對N型鈣通道的作用，我們選用爪蟾卵母細胞為研究模型。將該受體和離子通道的cRNA首先分別注入卵母細胞作為對照組。通過雙電極電壓鉗記錄得到N型鈣電流，并運用Western Blot得到Sig

15、ma-1受體的蛋白表達，以上結果可以說明獨立表達Sigma-1受體和N型鈣通道的卵母細胞表達模型建立成功。
　　5、為研究二者之間的相互作用，需建立同時表達Sigma-1受體和N型鈣通道的表達體系。將兩者的cRNA以體積比1:1混合均勻后注入卵母細胞，48 h后開始記錄，結果顯示，未能記錄到正常的N型鈣電流。通過逐漸降低Sigma-1受體的體積比，保持N型鈣通道的體積不變，在Sigma-1受體與N型鈣通道的體積比為0.5:1、0.

16、25:1、0.125:1、0.0625:1、0.03125:1比例條件下，記錄到的N型鈣電流幅度分別為單獨表達的N型鈣通道的電流幅度的29.9%±3.9%(n=18,P<0.001),52.6%±3.8%(n=17,P<0.001),72.1%±3.7%(n=26,P<0.001),85.0%±5.8%(n=17,P<0.05),89.9%±7.5%(n=10,P>0.05)。由此得出結論，N型鈣電流的幅度隨著Sigma-1受體表達的減

17、少而增大，并且這種作用是配體非依賴性的。
　　6、為了觀察Sigma-1受體對N型鈣通道在同時表達二者的卵母細胞中是否存在配體依賴型作用，我們選擇體積比為Sigma-1受體: N型鈣通道=0.25:1的卵母細胞作為研究對象。在此條件下，既有Sigma-1受體的表達，也可同時記錄到N型鈣電流。通過電生理方法，分別給以卵母細胞1μM、5μM、25μM、50μM、100μM的SKF-10047，得到其鈣電流分別被抑制至原電流的94.9%

18、±1.6%(n=8,P<0.05),89.9%±1.1%(n=20,P<0.005),83.0%±0.7%(n=10,P<0.001),73.5%±6.5%(n=7,P<0.001),67.7%±3.7%(n=5,P<0.001)。發(fā)現(xiàn)SKF-10047在該條件下均對N型鈣通道有抑制作用。為驗證該抑制作用是由Sigma-1受體介導的，向其記錄液中加入Sigma-1受體拮抗劑50μM BD-1063,其對N型鈣通道則無明顯抑制作用（抑制至

19、原電流幅度的93.2%±2.1%, n=6,P>0.05）。同時將50μM SKF-10047與50μM BD-1063加入記錄液中，發(fā)現(xiàn)BD-1063可以阻斷SKF-10047對N型鈣通道的抑制作用（此時記錄到的電流為原電流的87.2%±2.2%, n=6,P>0.05）。由此可知，SKF-10047對N型鈣通道的抑制作用是由Sigma-1受體介導的。該結果與在ChIs上得到的結果是一致的。
　　7、為研究胞內(nèi)鈣釋放通道對N型鈣

20、電流是否有影響，向電極內(nèi)液中加入胞內(nèi)鈣釋放通道的特異性阻斷劑進行胞內(nèi)給藥。將胞內(nèi)鈣螯合劑20 mM BAPTA、IP3受體特異阻斷劑100μM2-APB、Ryanodine受體特異性阻斷劑10μM釕紅分別加入電極內(nèi)液，首先記錄N型鈣電流作為組內(nèi)對照組，然后向記錄液中加入100μM SKF-10047，統(tǒng)計細胞在受到Sigma-1受體激動劑刺激之前與之后的N型鈣電流的差異。結果顯示：100μM SKF-10047在BAPTA、釕紅和2-A

21、PB存在時對N型鈣電流的抑制作用分別為抑制至原電流的：83.4%±2.3%(n=6,P<0.05)、86.9%±1.1%(n=7,P<0.05)、93.9%±1.1%(n=5,P<0.05)，單獨100μM SKF-10047的作用為67.7%±3.7%(n=5,P<0.05)。
　　8、由以上結果，我們提出假設：Sigma-1受體與N型鈣通道在細胞內(nèi)可能存在直接的蛋白相互作用或是二者之間的距離非常接近。為便于直觀地觀察到質(zhì)粒的表

22、達，我們選用HEK-293T細胞作為表達體系。利用熒光共聚焦顯微鏡，觀察到Sigma-1受體(紅色)與N型鈣通道(綠色)均可正常表達。在同時轉染兩種蛋白的細胞內(nèi)，黃色熒光結果顯示Sigma-1受體與N型鈣通道可同時正常表達，并可能存在共定位。
　　9、為確證Sigma-1受體與N型鈣通道之間是否存在共定位，我們采用熒光共振能量轉移實驗(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)初步驗證

23、這一猜想。符合熒光面積大于0.02m2，熒光強度大于或等于0.5條件的信號點可以認為存在蛋白-蛋白相互作用。實驗結果顯示，在共同轉染Sigma-1受體與N型鈣通道的細胞內(nèi)，11個觀察視野下，共有203個符合條件的信號點。而在陰性對照組中，沒有發(fā)現(xiàn)符合條件的信號。初步得出結論：Sigma-1受體與N型鈣通道在HEK-293T細胞中可以形成蛋白-蛋白直接相互作用。
　　10、利用免疫共沉淀實驗進一步驗證受體-離子通道蛋白復合體的存在。

24、結果顯示，Sigma-1受體的抗體或N型鈣通道的抗體可以將Sigma-1受體與N型鈣通道一并通過免疫作用沉淀下來。在陰性對照實驗組中，未能觀察到相應的或特異性的免疫印跡條帶。這表明二者之間確實存在蛋白質(zhì)之間的相互作用。通過以上實驗結果，我們可知本研究首次在大鼠背側紋狀體的ChIs中發(fā)現(xiàn)
　　Sigma-1受體的表達。并且利用電生理學技術在大鼠腦片組織中的ChIs以及外源爪蟾卵母細胞中發(fā)現(xiàn)，Sigma-1受體可以配體依賴性地抑制N型

25、鈣電流。在爪蟾卵母細胞中，外源性表達的Sigma-1受體可以同時以配體非依賴性的方式抑制N型鈣電流，并且該抑制作用與Sigma-1受體的蛋白表達量呈正相關的趨勢。分子生物學實驗表明外源性的Sigma-1受體與N型鈣通道可以在HEK-293T細胞中形成蛋白復合體。由此可知，Sigma-1受體對N型鈣通道的負性調(diào)節(jié)作用可能是通過蛋白-蛋白相互作用以及激動劑誘導的受體變構調(diào)節(jié)作用引起的。據(jù)此，我們推測Sigma-1受體可以通過調(diào)節(jié)N型鈣通道的