局部應(yīng)用殼聚糖-磷酸甘油-神經(jīng)生長因子緩釋凝膠聯(lián)合靜脈導(dǎo)管治療大鼠面神經(jīng)損傷的實驗研究.pdf

1、目的:
　　近年來生物材料及神經(jīng)導(dǎo)管技術(shù)在治療周圍神經(jīng)損傷中取得了一定的進展，但其臨床效果并不理想。本實驗的主要目的:1）研究殼聚糖-β-磷酸甘油(C/GP)凝膠是否可以在靜脈導(dǎo)管中起到支架作用;2）研究采用自體靜脈作為神經(jīng)導(dǎo)管，并在導(dǎo)管內(nèi)注入殼聚糖-β-磷酸甘油-神經(jīng)生長因子緩釋凝膠(C/GP-NGF)修復(fù)大鼠面神經(jīng)缺損的效果。
　　方法:
　　首先，體外制備C/GP-NGF緩釋凝膠及C/GP凝膠，并觀察凝膠特性。采

2、用掃描電鏡觀察C/GP-NGF及C/GP凝膠的超微結(jié)構(gòu)。采用NGF-ELISA試劑盒檢測NGF在12小時、1天、3天、5天、7天、9天及12天時的釋放量，并繪制NGF的體外釋放曲線。動物實驗共使用75只成年雌性Wistar大鼠（體重220克-250克），隨機分為5組(n=15)。首先制備大鼠右側(cè)面神經(jīng)上頰支缺損5mm動物模型。A組（自體神經(jīng)移植組）:將切斷的神經(jīng)翻轉(zhuǎn)后縫合于神經(jīng)缺損處。B組-E組，采用大鼠自體頸外靜脈修復(fù)面神經(jīng)上頰支神經(jīng)

3、缺損，并分別在靜脈導(dǎo)管中注入C/GP-NGF凝膠（C/GP-NGF組）、NGF溶液（NGF組）、C/GP凝膠（C/GP組）、及PBS溶液（PBS組）。所有大鼠均暴露左側(cè)面神經(jīng)頰支，但不做任何處理，作為對照。術(shù)后4周、8周及12周，評估各組大鼠觸須運動功能;同時記錄各組大鼠面神經(jīng)復(fù)合動作電位(CMAPs);并分析CMAPs的最大振幅及再生神經(jīng)傳導(dǎo)速度。組織學(xué)檢查在術(shù)后4周、8周及12周，采用改良三色染色觀察再生神經(jīng)的形態(tài);并在術(shù)后12周采

4、用甲苯胺藍染色及透射電鏡的方法來分析再生神經(jīng)纖維直徑大小、髓鞘的厚度及再生軸突的密度。此外，本實驗采用Tubulin與S-100雙重免疫熒光的方法來評估再生神經(jīng)纖維，并分析各組大鼠再生神經(jīng)中Tubulin陽性顆粒的密度。
　　結(jié)果:
　　體外實驗結(jié)果:C/GP凝膠在室溫下為液體，放置在37℃恒溫箱中30分鐘后變?yōu)槟z狀。掃描電鏡下發(fā)現(xiàn)C/GP凝膠及C/GP-NGF凝膠中含有大量的孔隙。C/GP-NGF凝膠在體外可以緩慢釋放N

5、GF超過12天。動物實驗結(jié)果:所有大鼠術(shù)后右側(cè)觸須運動消失。自體神經(jīng)移植組中大鼠觸須運動恢復(fù)最快，但與C/GP-NGF組中大鼠觸須運動恢復(fù)速度相似，且差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。C/GP-NGF組中大鼠觸須運動恢復(fù)速度較PBS組快，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。NGF組及C/GP組中大鼠觸須運動評分值與PBS組相似，且差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。電生理學(xué)檢查結(jié)果顯示:術(shù)后4周，自體神經(jīng)移植組及C/GP-NGF組中可以記錄

6、到大鼠面神經(jīng)的CMAPs，但在其它組中記錄不到;術(shù)后8周及12周，所有實驗組均可記錄到面神經(jīng)的CMAPs。C/GP-NGF組中CMAPs的振幅及神經(jīng)傳導(dǎo)速度與自體神經(jīng)移植組相似，且差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與C/GP-NGF組相比，NGF組、C/GP組及PBS組中大鼠CMAPs的振幅較小且神經(jīng)傳導(dǎo)速度較慢，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。NGF組及C/GP組中大鼠CMAPs的振幅及神經(jīng)傳導(dǎo)速度與PBS組比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P

7、＞0.05）。三色染色結(jié)果顯示:術(shù)后4周，再生神經(jīng)橫切面中可見再生軸突，但軸突較小且排列紊亂;術(shù)后8周及12周，再生神經(jīng)不斷成熟，且自體神經(jīng)移植組及C/GP-NGF組中再生神經(jīng)較其它三組成熟并且排列規(guī)整。此外，術(shù)后4周，C/GP-NGF組及C/GP組中大部分的殼聚糖凝膠已被吸收，神經(jīng)橫切面中僅見少量未被吸收的凝膠;術(shù)后8周，C/GP-NGF組及C/GP組再生神經(jīng)橫切面中可見極少量的顆粒狀未被吸收的殼聚糖凝膠;術(shù)后12周，C/GP-NGF

8、組及C/GP組再生神經(jīng)橫切面中未見殼聚糖凝膠。甲苯胺藍染色及透射電鏡結(jié)果顯示:自體神經(jīng)移植組中再生神經(jīng)纖維直徑較C/GP-NGF組大，且再生神經(jīng)髓鞘較C/GP-NGF組厚，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;C/GP-NGF組中再生神經(jīng)纖維直徑較NGF組、C/GP組及PBS組中大，且髓鞘較厚，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;C/GP-NGF組再生軸突密度與自體神經(jīng)移植組相似，并且明顯的比NGF組、C/GP組及PBS組高(P＜0.05);

9、NGF組及C/GP組再生神經(jīng)的直徑、髓鞘厚度及神經(jīng)纖維密度與PBS組比較，差別無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。Tubulin及S-100雙重免疫熒光結(jié)果顯示，再生神經(jīng)切片中軸突及髓鞘可以被特異性標記物染色。并且C/GP-NGF組中Tubulin陽性顆粒的密度與自體神經(jīng)移植組相似，且比NGF組、C/GP組及PBS組高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　C/GP凝膠在靜脈導(dǎo)管中既可以作為支架維持靜脈導(dǎo)管的管狀