幽門螺桿菌臨床株分離及東亞與西方型菌株比較分析.pdf

1、目的：分離鑒定幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)臨床株，分析其細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白(Cytotoxinassociated gene A protein, CagA)磷酸化基序EPIYA的結(jié)構(gòu)特點，比較H.pylori東亞株和西方株CagA蛋白的結(jié)構(gòu)差異，初步探討東亞型和西方型CagA對細(xì)胞增殖與凋亡的影響。
　　方法:選取胃相關(guān)疾病患者的胃黏膜組織，剪碎后接種于哥倫比亞血瓊脂平板，微需氧培養(yǎng)，

2、菌落生長后通過尿素酶試驗、革蘭染色及顯微鏡檢查對H.pylori進行初步鑒定。提取菌落基因組，PCR擴增H.pylori16S rRNA基因并進行測序鑒定；擴增cagA基因全長序列，連接入 pMD18-T載體，將重組載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)DH5α，挑起陽性克隆，測序鑒定；利用DNAStarV7.1和MEGA6軟件對cagA序列進行比對及聚類分析。應(yīng)用多個生物數(shù)據(jù)庫和多種生物學(xué)軟件對 H. pylori CagA蛋白進行信

3、息學(xué)分析；將東亞、西方型全長cagA基因定向克隆入pcDNA3.1真核表達載體，獲得的陽性克隆測序鑒定后轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株MKN-45，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測CagA對細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　結(jié)果：成功分離H.pylori臨床株共26株；構(gòu)建pMD18-T/cagA克隆載體后對26株H.pylori的cagA基因全長測序，序列比對分析顯示有6株為西方型，20株為東亞型。東亞型CagA第815~834位點存在13個氨基酸的缺失、部分缺失

4、或變異，西方型中有3株丟失磷酸化位點EPIYA-C；聚類分析顯示H.pylori分離株分別聚類為東亞群、西方型東亞群以及西方群3群，與東亞國家日本菌株的同源性最高，共同聚類于東亞群。選取CagA/GZ7（典型東亞株）和CagA/26695（典型西方株）進行理化特性分析和空間構(gòu)像預(yù)測，結(jié)果顯示 CagA/26695有1184個氨基酸，分子量為132.36kDa，等電點為8.93；CagA/GZ7有1175個氨基酸，分子量為131.32kD

5、a，等電點為8.30；兩種菌株的CagA蛋白空間結(jié)構(gòu)較為相似，均為親水性的穩(wěn)定蛋白，位于胞質(zhì)內(nèi)，但其抗原肽段的位置、二級結(jié)構(gòu)的組成及保守結(jié)構(gòu)域在東亞型和西方型CagA之間存在差異。與對照組pcDNA3.1細(xì)胞比較，高表達cagA的細(xì)胞：pcagA/26695細(xì)胞組和 pcagA/GZ7細(xì)胞組的凋亡百分率分別為8.29±0.61和9.98±1.07，均高于對照組細(xì)胞（5.38±0.61），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01）；雖然pcagA

6、/GZ7細(xì)胞組的凋亡率稍高于pcagA/26695細(xì)胞組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。細(xì)胞周期結(jié)果顯示：pcagA/26695細(xì)胞組和 pcagA/GZ7細(xì)胞組G0-G1期細(xì)胞百分率均高于pcDNA3.1細(xì)胞組（百分率分別為36.14〒3.16，36.56〒1.62和30.88〒1.03），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；S期細(xì)胞均顯著低于pcDNA3.1細(xì)胞組（百分率分別為48.57〒2.90，48.01〒2.22和54.5

7、7〒1.52，P<0.05），而G2-M期細(xì)胞百分率在三組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（百分率分別為15.29〒0.43，15.42〒0.59和14.55〒0.88，P>0.05），各細(xì)胞周期的百分率在pcagA/26695細(xì)胞組和pcagA/GZ7細(xì)胞組之間也無顯著差異。
　　結(jié)論：H.pylori臨床分離株以東亞株為主，但也存在西方株感染；東亞型和西方型CagA存在結(jié)構(gòu)差異；臨床分離株之間存在聚類關(guān)系，與日本株同源性較高；生物信息學(xué)預(yù)