肌球蛋白X對神經(jīng)軸突生長的調(diào)控.pdf

1、在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，新生神經(jīng)元的軸突要經(jīng)歷一定的距離才能到達(dá)預(yù)定靶區(qū)，與靶區(qū)神經(jīng)元建立突觸聯(lián)系進(jìn)而形成精密復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)。神經(jīng)元的正確遷移及其軸突生長方向的精確導(dǎo)向是形成腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞環(huán)路的基礎(chǔ)。然而，軸突發(fā)育異常通常會導(dǎo)致多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括先天性智力障礙和癲癇等。因此，研究軸突生長的分子機(jī)制對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療具有重要的意義。 肌球蛋白X（myosin X，Myo X）是肌球蛋白家族中的一個成員，1994年通過PCR

2、技術(shù)首次在內(nèi)耳中克隆到myosin X的基因。Myo X為脊椎動物所特有的一種動力蛋白，在全身大多數(shù)組織中表達(dá)，包括神經(jīng)組織。在許多體外培養(yǎng)的細(xì)胞系，如Hela，HEK-293，COS-7，CAD細(xì)胞，Myo X定位在細(xì)胞絲足的頂端，承擔(dān)著絲足間的運動，促進(jìn)絲足的形成和穩(wěn)定。Immunoblotting實驗結(jié)果顯示，Myo X在腦內(nèi)顯示出動態(tài)的發(fā)育模式：在小鼠的大腦組織，Myo X在出生后的5天至15天表達(dá)量達(dá)到高峰，而在成年期表達(dá)量很

3、低。神經(jīng)系統(tǒng)許多發(fā)育事件發(fā)生在出生后的早期，包括突起的生長和突觸的形成，Myo X與絲足的密切關(guān)聯(lián)，表明了Myo X可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架系統(tǒng)進(jìn)一步影響神經(jīng)突起的發(fā)育。 本實驗采用體外培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)元作為模型來研究Myo X對神經(jīng)元軸突和樹突生長的調(diào)控作用。體外培養(yǎng)（day in vitro， DIV）5天的原代神經(jīng)元，抗Myo X抗體免疫熒光染色顯示內(nèi)源Myo X在神經(jīng)細(xì)胞的胞體、軸突和樹突中都有表達(dá)，分別與軸突標(biāo)志蛋

4、白Tau-1和樹突標(biāo)志蛋白MAP2共定位。利用構(gòu)建的鼠Myo X—siRNA表達(dá)載體電轉(zhuǎn)染分離的海馬神經(jīng)元，培養(yǎng)72小時后，免疫熒光染色，共聚焦顯微鏡下觀察，表達(dá)scramble—siRNA的神經(jīng)元形成一個長的軸突和3～5個樹突，呈現(xiàn)典型的錐體神經(jīng)元形態(tài)，表達(dá)Myo X—siRNA的神經(jīng)元則表現(xiàn)為幾個樹突樣分枝，未見典型的軸突表型。磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將Myo X—siRNA轉(zhuǎn)染于體外培養(yǎng)48小時的海馬神經(jīng)元（DIV2，Stage3），繼續(xù)培養(yǎng)

5、48小時后，免疫染色結(jié)果表明，神經(jīng)樹突減少，神經(jīng)軸突未見明顯差異。進(jìn)一步，用Myo X—siRNA電轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元，體外培養(yǎng)5天后，用軸突特異抗體anti—Tau-1免疫染色，發(fā)現(xiàn)在表達(dá)Myo X—siRNA的神經(jīng)元中，有許多神經(jīng)元不再具有一個很長的軸突樣的突起，在所有突起中沒有顯示出可標(biāo)記的Tau-1陽性染色，這類神經(jīng)元占所有表達(dá)Myo X—siRNA神經(jīng)元的90．5％，表明這些神經(jīng)元極性特征已經(jīng)喪失。綜上所述，減低內(nèi)源的Myo X的