基于miR-29b調(diào)節(jié)SP1-IL-10對(duì)D-IBS合并2型糖尿病肝郁脾虛證的分子生物學(xué)研究.pdf

1、腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome，IBS)是一種以腹痛或腹部不適為主，伴有大便性狀改變的功能性胃腸病，全球總患病率為5％-30％，國(guó)內(nèi)IBS就診率占消化內(nèi)科門診病人總數(shù)的34.3％，臨床上以腹瀉型腸易激綜合征(Diarrhea-predominant irritable bowelsyndrome，D-IBS)較多見(jiàn)。D-IBS屬中醫(yī)“腹瀉”、“腹痛”等范疇，脾主運(yùn)化，肝主疏泄，當(dāng)脾胃的運(yùn)化、肝的疏泄功能和

2、升清降濁功能、大腸的傳導(dǎo)功能及腎的溫煦功能失調(diào)，均可能導(dǎo)致D-IBS的發(fā)生。本病的發(fā)病常由于飲食不節(jié)、情志失調(diào)誘發(fā)，肝郁脾虛為主要發(fā)病機(jī)制。由于D-IBS發(fā)病機(jī)制的多因素性、復(fù)雜性，導(dǎo)致其難以治愈、癥狀長(zhǎng)期存在或反復(fù)發(fā)作，患者頻繁就醫(yī)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和心身健康。有研究發(fā)現(xiàn)IBS患者，糖尿病前期發(fā)生率要明顯高于健康人群，究竟在D-IBS患者中2型糖尿病的發(fā)病情況如何，D-IBS合并2型糖尿病患者中醫(yī)證型、精神心理狀況及生活質(zhì)量等均未

3、見(jiàn)報(bào)道。
　　microRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)約21-23nt的內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA，可通過(guò)與靶基因完全或不完全互補(bǔ)，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)編碼蛋白的基因表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用。部分研究學(xué)者認(rèn)為miRNA在IBS的發(fā)生發(fā)展中異常表達(dá)，但真正確認(rèn)功能的miRNA只有一部分。目前關(guān)于D-IBS合并2型糖尿病miRNA表達(dá)譜的研究鮮有報(bào)道，差異表達(dá)的miRNAs在D-IBS合并2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)過(guò)程中究竟發(fā)揮怎樣的作用尚未完全清楚。

4、
　　本研究首先對(duì)D-IBS患者與同期體檢者的2型糖尿病發(fā)病情況進(jìn)行臨床調(diào)查，并對(duì)D-IBS合并2型糖尿病患者和單純D-IBS患者進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查，問(wèn)卷內(nèi)容包括:一般人口學(xué)特征、中醫(yī)證型、精神心理狀況及生活質(zhì)量量表(IBS-quality of life measure，IBS-QOL);其次，對(duì)D-IBS合并2型糖尿病患者、單純D-IBS患者、2型糖尿病患者及對(duì)照組進(jìn)行血漿miRNA表達(dá)譜進(jìn)行研究，篩選D-IBS合并2型糖尿病差異表

5、達(dá)的特異miRNA，qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)的miRNAs，生物信息學(xué)分析可能的發(fā)病機(jī)制;最后建立D-IBS合并2型糖尿病肝郁脾虛證大鼠模型，探討miR-29b在D-IBS合并2型糖尿病肝郁脾虛證模型大鼠中的作用機(jī)制及生物學(xué)功能，為該病的中西醫(yī)結(jié)合臨床診斷及治療奠定理論基礎(chǔ)。本研究?jī)?nèi)容共分四部分:
　　第一部分 D-IBS合并2型糖尿病患者中醫(yī)病證及生活質(zhì)量研究
　　目的:了解我國(guó)D-IBS患者糖尿病的發(fā)病情況及D-IBS

6、合并2型糖尿病患者一般人口學(xué)特征、中醫(yī)證型、精神心理狀況及生活質(zhì)量。
　　方法:收集2013年5月至2015年5月?lián)P州大學(xué)臨床附屬醫(yī)院江蘇省蘇北人民醫(yī)院消化門診就診的D-IBS患者388例，研究對(duì)象均符合羅馬Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)，并且排除與癥狀相關(guān)的器質(zhì)性疾病;對(duì)照組為上述相應(yīng)的醫(yī)療單位健康體檢者220人;兩組均進(jìn)行血糖測(cè)定。對(duì)入組患者進(jìn)行臨床問(wèn)卷調(diào)查，問(wèn)卷內(nèi)容包括:一般人口學(xué)特征、中醫(yī)證型、精神心理狀況及生活質(zhì)量。
　　結(jié)果:1、D

7、-IBS組2型糖尿病發(fā)病率為46.4％，與同期體檢者(15.5％)相比差異顯著(p＜0.05)，且2型糖尿病發(fā)病與D-IBS病程長(zhǎng)短有關(guān)，D-IBS病程越長(zhǎng)，合并2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)越高;2、180例D-IBS合并2型糖尿病患者中，肝郁脾虛證134例，占74.4％，脾腎陽(yáng)虛證22例，占12.2％，脾虛濕困證17例，占9.5％，脾胃濕熱證7例，占3.9％;3、D-IBS合并2型糖尿病患者存在更嚴(yán)重的消化道癥狀;4、D-IBS合并2型糖尿病患者存

8、在更嚴(yán)重的焦慮及抑郁;5、D-IBS合并2型糖尿病患者在煩躁不安、健康憂慮、沖突行為及飲食限制四個(gè)維度方面的生活質(zhì)量明顯下降。
　　結(jié)論:D-IBS患者2型糖尿病的發(fā)病率明顯高于健康體檢者，提示D-IBS可能是2型糖尿病的高風(fēng)險(xiǎn)因素之一;D-IBS合并2型糖尿病患者以肝郁脾虛證為主型，且這部分患者的胃腸道癥狀、精神心理狀態(tài)及生活質(zhì)量明顯低于D-IBS。
　　第二部分 D-IBS合并2型糖尿病血漿miRNA表達(dá)譜及miR-29

9、b差異表達(dá)的研究
　　目的:研究D-IBS合并2型糖尿病血漿miRNA表達(dá)譜，篩選差異表達(dá)的miRNAs，并對(duì)差異表達(dá)miRNA靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　方法:隨機(jī)選取D-IBS合并2型糖尿病、D-IBS、2型糖尿病、健康對(duì)照組各3例血漿標(biāo)本，采用miRNA寡核苷酸芯片進(jìn)行檢驗(yàn)分析，篩選出差異表達(dá)的miRNA;采用GO(Gene ontology)分析及KEGG(Kyoto encyclopedia of genes

10、and genomes)分析對(duì)差異表達(dá)的miRNA靶基因進(jìn)行生物進(jìn)程、細(xì)胞組分、分子功能、信號(hào)通路分析;根據(jù)芯片結(jié)果及文獻(xiàn)，篩選出代表性的差異表達(dá)miRNA，采用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Quantificationalreal-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)技術(shù)在大樣本血漿中進(jìn)一步驗(yàn)證，根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果對(duì)miRNA進(jìn)行受試者工作特征(Receiver operating characteris

11、tic，ROC)分析。
　　結(jié)果:1、D-IBS合并2型糖尿病組差異表達(dá)的miRNA有35個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的miRNA有6個(gè)，下調(diào)表達(dá)的miRNA有29個(gè);2、生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)miRNA的靶基因與細(xì)胞核內(nèi)DNA依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)水平及蛋白綁定關(guān)系最為密切;3、D-IBS合并2型糖尿病患者血漿中miR-106b、miR-29b、miR-26a存在不同程度的表達(dá)上調(diào)，與miRNA芯片篩選結(jié)果一致。ROC分析結(jié)果顯示miR-

12、29b ROC曲線下面積（Area under roccurve，AUC)＞0.9，說(shuō)明其作為D-IBS合并2型糖尿病診斷標(biāo)志物有較高的準(zhǔn)確性。
　　結(jié)論:通過(guò)基因芯片篩查D-IBS合并2型糖尿病患者血漿中存在35個(gè)差異表達(dá)的miRNA，且miR-29b呈特異性高表達(dá)，研究結(jié)果有望為D-IBS合并2型糖尿病的診斷提供一種新的非侵入性的分子診斷方法。生物信息學(xué)分析提示差異表達(dá)的miRNAs的靶基因與細(xì)胞核內(nèi)DNA依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)水平及

13、蛋白綁定關(guān)系最為密切。
　　第三部分 D-IBS合并2型糖尿病大鼠肝郁脾虛證模型的建立與評(píng)價(jià)
　　目的:探索D-IBS合并2型糖尿病肝郁脾虛證大鼠模型的建立方法。
　　方法:4周齡SPF級(jí)Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為普通飲食組和高脂飲食組。高脂飲食組喂養(yǎng)4周后，小劑量(35mg/kg)多次腹腔注射新鮮配制的鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)溶液，隨機(jī)血糖超過(guò)11.1 mmol/L的大鼠視為2型

14、糖尿病模型成功制備。2型糖尿病模型成功建立后，隨機(jī)選取10只建立D-IBS肝郁脾虛證模型，同時(shí)普通飲食組隨機(jī)選取10只建立D-IBS肝郁脾虛證模型。造模前禁食不禁水12h，予以生大黃溶液(1 g/mL)灌胃，2mL/只，每日兩次。在灌服生大黃溶液1h后用寬透明膠帶束縛大鼠的肩部、前肢及胸部，限制大鼠用前肢搔抓頭面部，但不限制其活動(dòng)，束縛時(shí)間為1h。造模持續(xù)4周。造模結(jié)束后，觀察各組大鼠一般情況、腹瀉情況、口-肛傳輸時(shí)間、內(nèi)臟敏感性檢測(cè)、

15、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)及近端結(jié)腸病理組織學(xué)變化。
　　結(jié)果:1、一般情況:D-IBS合并2型糖尿病組飲水量、攝食量、尿量明顯增多，體重明顯減輕;2、D-IBS合并2型糖尿病組大便積分明顯變大，含水量明顯增多，稀便級(jí)明顯增加;3、D-IBS合并2型糖尿病組口-肛傳輸時(shí)間明顯減少，內(nèi)臟敏感性明顯增加，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中總路程、平均速度及進(jìn)入中央?yún)^(qū)活動(dòng)的時(shí)間明顯降低;4、各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯器質(zhì)性改變，除對(duì)照組外，D-IBS合并2型糖尿病組、D-

16、IBS組、糖尿病組結(jié)腸組織粘膜輕度水腫，偶見(jiàn)上皮細(xì)胞排列不整，局部少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　結(jié)論:高脂飲食+鏈脲佐菌素+慢性束縛+大黃煎煮液灌胃是復(fù)制D-IBS合并2型糖尿病肝郁脾虛證動(dòng)物模型較為合理的造模方法;基于血糖、大便特征、腸道敏感性和病理組織學(xué)改變是判定D-IBS合并2型糖尿病肝郁脾虛證動(dòng)物模型是否成功的重要依據(jù)。
　　第四部分基于miR-29b調(diào)節(jié)SP1/IL-10對(duì)D-IBS合并2型糖尿病肝郁脾虛證的分子生物學(xué)研

17、究
　　目的:研究miR-29b是否通過(guò)靶定SP1基因降低IL-10表達(dá)參與D-IBS合并2型糖尿病發(fā)病機(jī)制。
　　方法:采用qRT-PCR方法驗(yàn)證模型組大鼠血漿中miR-29b表達(dá)情況;構(gòu)建MSCV-PIG-miR-29b質(zhì)粒、PGL3-SP13'UTR質(zhì)粒和PGL3-SP13'UTR(mut)質(zhì)粒，通過(guò)雙熒光報(bào)告基因和過(guò)表達(dá)miR-29b驗(yàn)證miR-29b對(duì)其靶基因SP1的直接調(diào)控作用;qRT-PCR方法、Western

18、-Blot及免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)不同動(dòng)物模型結(jié)腸組織中SP1 mRNA和SPI蛋白的表達(dá)情況，ELASA方法檢測(cè)血漿中IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α的表達(dá)。
　　結(jié)果:1、D-IBS合并2型糖尿病模型組大鼠血漿中miR-29b表達(dá)量明顯增多，與對(duì)照組相比差異顯著(p＜0.05);2、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示miR-29b能夠通過(guò)作用于SP13'UTR區(qū)的特定位點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié);3、D-IBS合并2型糖尿病模型組結(jié)腸組織

19、中SP1 mRNA和SP1蛋白表達(dá)量明顯降低;4、與其他三組相比，D-IBS合并2型糖尿病組IL-10表達(dá)明顯下降。
　　結(jié)論:miR-29b可能是通過(guò)靶定SP1基因降低IL-10表達(dá)參與D-IBS合并2型糖尿病肝郁脾虛證發(fā)病機(jī)制。
　　綜上所述:D-IBS組2型糖尿病發(fā)病率明顯高于健康體檢者，且D-IBS合并2型糖尿病患者以肝郁脾虛證為主型，患者伴有心理異常，生活質(zhì)量明顯下降;miRNA芯片篩查發(fā)現(xiàn)D-IBS合并2型糖尿病

20、患者血漿中存在35個(gè)差異表達(dá)miRNA，miR-29b呈特異性高表達(dá)，生物信息學(xué)分析提示差異miRNAs的靶基因與細(xì)胞核內(nèi)DNA依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)水平及蛋白綁定關(guān)系最為密切;通過(guò)高脂飲食+鏈脲佐菌素+慢性束縛+大黃煎煮液灌胃是復(fù)制D-IBS合并2型糖尿病肝郁脾虛證動(dòng)物模型較為合理的造模方法;SP1是miR-29b直接靶基因之一，D-IBS合并2型糖尿病模型組大鼠血漿中miR-29b明顯增高，腸組織中SP1mRNA及SP1蛋白表達(dá)水平明顯下降