麻瘋樹水通道蛋白JcPIP2的分離、基因克隆及功能鑒定與調(diào)控分析.pdf

1、麻瘋樹(Jatropha curcas L)是一種大戟科(Euphorbiaceae)的油料植物，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。它具有極強(qiáng)的抗旱性，甚至可以在沙漠地區(qū)正常生長。為了研究麻瘋樹抗旱性的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)分離了一個(gè)與抗旱密切相關(guān)的植物水通道蛋白JcPIP2并展開了功能研究。 1、麻瘋樹JcPIP2蛋白的分離及基因克隆 本文采用兩相法從麻瘋樹幼苗組織中提取質(zhì)膜囊泡組織，再進(jìn)行質(zhì)膜內(nèi)膜蛋白的分離。在SDS—PAGE電

2、泳下分離出一條分子量為29KDa的蛋白富集帶。由于其與菠菜葉肉細(xì)胞分離出的質(zhì)膜內(nèi)膜蛋白富集帶分子量相近，被選擇進(jìn)行質(zhì)譜分析。將質(zhì)譜分析所得的數(shù)據(jù)在NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)一條最長的屬于植物PIP蛋白的肽段：NPYNHLLGGGANSVNTGYSK。根據(jù)該肽段結(jié)合麻瘋樹已有基因密碼子的偏愛性設(shè)計(jì)簡并引物進(jìn)行麻瘋樹PIP基因的克隆。采用RT-PCR和RACE技術(shù)成功克隆了麻瘋樹JcPIP2基因。其cDNA全長為985 bp，包

3、括一個(gè)843bp的完整的開放閱讀框(ORF)，39bp的5'-非翻譯區(qū)片段和103bp的3'-非翻譯區(qū)片段。GenBank登錄號為：EF030420。以開放閱讀框的cDNA序列兩端設(shè)計(jì)引物進(jìn)行DNA克隆得到一個(gè)長為1273bp的序列，與cDNA序列比較分析發(fā)現(xiàn)有3個(gè)內(nèi)含子。JcPIP2基因的ORF編碼280個(gè)氨基酸。 2、生物信息學(xué)分析 同源性分析表明JePIP2和其它植物的PIP氨基酸序列間有很高的同源性，其中與蓖麻P

4、IP的同源性最高(94％)。與已經(jīng)鑒定出蛋白三維晶體結(jié)構(gòu)的菠菜SoPM28A的同源性也高達(dá)86％。對蛋白疏水區(qū)和跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測表明該蛋白有六個(gè)跨膜區(qū)和5個(gè)親水環(huán)，整個(gè)蛋白的疏水性很強(qiáng)屬于典型的膜蛋白的特征。對JePIP2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，JcPIP2的三級結(jié)構(gòu)和菠菜PIP2的晶體結(jié)構(gòu)極為相似，主要由6個(gè)跨膜的α-螺旋和5個(gè)親水環(huán)(LoopA、B、C、D、E)連接，其中A、C、E環(huán)位于胞膜外側(cè)，B、D環(huán)及氨基和羧基末端位于胞膜內(nèi)側(cè)。羧基

5、端和氨基端有高度相似的氨基酸序列且縱向重復(fù)，多肽鏈的兩端顯示明顯的對稱性，每端(胞外的E環(huán)、胞內(nèi)的B環(huán)上)由高度保守的天門冬酰胺．脯氨酸-丙氨酸(Asn-Pro-Ala，NPA)組成一個(gè)小的結(jié)構(gòu)域--NPA基序，NPA基序高度保守。對JePIP2蛋白的化學(xué)修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白有5個(gè)磷酸化位點(diǎn)，為研究JcPIP2蛋白的磷酸化調(diào)控墊定了基礎(chǔ)。 3、Southem雜交 用限制性內(nèi)切酶EcoR I、BamHI、Sac I和

6、Kpn I將基因組DNA酶切消化，每種酶切產(chǎn)物至少可以產(chǎn)生2條雜交帶，說明JcPIP2在麻瘋樹基因組中至少有2個(gè)以上拷貝。 4、Northern及Western雜交 麻瘋樹水通道蛋白JePIP2廣泛分布于麻瘋樹的各個(gè)組織。雖然其基因的表達(dá)和蛋白分布不是一一對應(yīng)的關(guān)系，但都共同反映了JcPIP2廣泛分布在麻瘋樹的各個(gè)組織。 5、JePIP2水通道蛋白功能的鑒定 在異源表達(dá)系統(tǒng)非洲爪蟾卵母細(xì)胞中對JcPIP2

7、蛋白的功能進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)該基因編碼一個(gè)功能的水通道蛋白。表達(dá)了JcPIP2基因的爪蟾卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜水通透性提高了10倍以上。 6、JcPIP2蛋白的亞細(xì)胞定位 為了研究JcPIP2的亞細(xì)胞定位情況，我們構(gòu)建了JcPIP2-GFP融合基因，將其在異源表達(dá)系統(tǒng)非洲爪蟾卵母細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)發(fā)現(xiàn)熒光信號只表現(xiàn)在細(xì)胞膜上，這說明麻瘋樹JcPIP2蛋白是一個(gè)膜蛋白，這一結(jié)論也與我們第一章質(zhì)譜分析的結(jié)果相吻合。 7、干