東方山羊豆水通道蛋白基因的克隆及初步分析.pdf

1、東方山羊豆(Galega orientalis)為多年生豆科草本植物，具有利用年限長、春季返青后長勢快、產(chǎn)量高、營養(yǎng)物質(zhì)(特別是粗蛋白)含量高且家畜采食不易發(fā)生鼓脹病并促進(jìn)奶牛泌乳等優(yōu)點(diǎn)。東方山羊豆可以鮮草、青貯、干草及脫水粒狀物等形式成為紫花苜蓿(Medicago sativa)的替代物。因此，是一個值得大面積推廣的牧草品種。但在西北等鹽堿地、干旱土地較多的地區(qū)，其推廣種植受到了很大的限制，因此研究山羊豆抗旱耐鹽基因，為東方山羊豆的抗

2、逆性改良提供依據(jù)和參考。
　　 水通道蛋白AQPs屬于古老的通道蛋白MIP(major intrinsic proteins)成員，在植物生長發(fā)育過程中介導(dǎo)多個生理途徑。水通道蛋白能夠增加生物膜對水分的透性，實(shí)現(xiàn)水分的長距離運(yùn)輸、快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)；通過調(diào)節(jié)自身的關(guān)閉限制植物體內(nèi)水分流失，維持水分，有效調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的滲透平衡，從而增加植物對水分脅迫的耐受能力。水通道蛋白還參與其他小分子的共質(zhì)體和跨細(xì)胞途徑運(yùn)輸，從而參與調(diào)控植物的一系列

3、重要生理過程，如光合作用、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和脅迫應(yīng)答反應(yīng)。
　　 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已知EST片段從東方山羊豆中克隆到一個水通道蛋白(AQP)基因，命名為GoAQP，并對其序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，基因表達(dá)特異性分析，基因表達(dá)載體構(gòu)建及基因的亞細(xì)胞定位分析，以期驗(yàn)證GoAQP基因在水分脅迫下的功能，為東方山羊豆在西北等鹽堿地、干旱土地較多的地區(qū)的種植推廣奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究包括以下內(nèi)容及結(jié)論：
　　 (

4、1)GoAQP基因的克隆及生物信息學(xué)分析
　　 利用東方山羊豆鹽脅迫下構(gòu)建的抑制差減雜交文庫中已知的GoAQP基因EST片段，結(jié)合RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆得到一個水通道蛋白(AQP)基因，命名為GoAQP，并將其登錄GenBank，登錄號：HM803185。通過測序和生物信息學(xué)分析表明，此序列全長1258 bp，開放讀碼框(ORF)870 bp，編碼289個氨基酸。GoAQP包含MIP家族信號序列HINPAVT/SFG，

5、高等植物PIP高度保守序列GGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VF/YN。運(yùn)用TMHMM軟件對GoAQP進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)其具有水通道蛋白典型的6個跨膜區(qū)。這些結(jié)果表明GoAQP為一個膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。將GoAQP蛋白氨基酸序列與擬南芥AQP基因家族的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，GoAQP屬于PIP1亞型AQP蛋白。通過ProtFun功能預(yù)測軟件預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其具有運(yùn)輸功能的可能性最高。
　　 (2)G

6、oAQP基因的表達(dá)特異性分析
　　 通過Real-Time PCR檢測了GoAQP基因在東方山羊豆中的組織表達(dá)特異性和不同逆境處理下的表達(dá)特點(diǎn)，結(jié)果表明：GoAQP基因在根中表達(dá)量最高，莖中表達(dá)量最少；GoAQP基因表達(dá)受NaCl、PEG脅迫表達(dá)上調(diào)，NaCl表達(dá)呈雙峰分布；外源激素ABA誘導(dǎo)GoAQP基因表達(dá)，初期表達(dá)上調(diào)并成雙峰分布，后期隨時間的增加而表達(dá)下調(diào)。表明GoAQP基因可能參與了東方山羊豆抗旱和耐鹽性的調(diào)控，這些調(diào)