麻瘋樹（Jatropha curcas）毒蛋白curcin2基因的原核表達.pdf

1、核糖體失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIP)是一類作用于rRNA而抑制核糖體功能的毒蛋白，廣泛存在于高等植物中。研究表明，RIP對于細(xì)菌真菌具有廣普抗性。另一方面，核糖體失活蛋白能抑制腫瘤病毒和艾滋病毒的生長。 麻瘋樹(Jatropha curcas)為大戟科麻瘋樹屬的一種油料植物，抗病蟲和耐干旱能力強，在熱帶和亞熱帶地區(qū)有大量分布，是一種具有較大開發(fā)潛能的植物。從麻瘋樹的種子中分離純化

2、到一種毒蛋白(curcin)，經(jīng)鑒定是一種核糖體失活蛋白，已克隆了其基因，并在大腸桿菌中成功表達。Curcin2是在低溫(或高溫)、干旱、真菌等逆境脅迫時，麻瘋樹產(chǎn)生的一種核糖體失活蛋白。為了進一步研究curcin2基因的結(jié)構(gòu)和功能，為開發(fā)利用curcin2奠定基礎(chǔ)，本實驗構(gòu)建了curcin2基因的兩種原核表達載體pET-C和pQE-C。并分別在E.coli B121和M15誘導(dǎo)表達，以比較curcin2基因的這兩種原核表達系統(tǒng)的差異。

3、在此基礎(chǔ)上，進一步研究了curcin2原核表達產(chǎn)物在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的存在形式。 (1)兩個原核表達載體的構(gòu)建：用根據(jù)curcin2基因序列(GenBank登錄號：AY435214)設(shè)計的擴增成熟肽編碼區(qū)的特異性引物:P1:5’-GGATCC(BamHI)ATGGCTGGTTCCACTTT-3’; P2 :5’-GAGGCTC ( Sac I )ATACATTGGAAAGATGAG GA-3’, 以提取的麻瘋樹基因組DNA為模板進行

4、PCR擴增，回收PER產(chǎn)物并連接到pMD18-T載體，獲重組子pMD-18T/curcin2，轉(zhuǎn)化E.coli JMl09。經(jīng)測序以驗證目的片段序列的正確性。用BamHI和SacI對重組質(zhì)粒pMD-18T/curcin和表達載體pET-32(c)、pQE-30進行雙酶切，回收目的片段，得到帶互補粘性末端的curcin2基因片段(約930 bp)和pETF-32(c)、pQE-30的線性表達載體。用T4 DNA連接酶將所得的目的片斷分別與

5、線形表達質(zhì)粒pET-32(c)、pQE-30在16V下連接，以構(gòu)建重組表達載體pETF-C和pQE-C。并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)的E.coli JMl09，經(jīng)菌落PCR、雙酶切及測序鑒定，證明目的片段curcin2正確插入表達載體，成功構(gòu)建原核表達載體pET-C和pQE-C。 (2)兩種重組菌的誘導(dǎo)表達：將含有重組子pET-C、pQE-C的E.coli JMl09轉(zhuǎn)化菌于37℃下擴大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒。把重組質(zhì)粒pET-C轉(zhuǎn)入感受

6、態(tài)的E.coliBL21，重組質(zhì)粒pQE-C轉(zhuǎn)入感受態(tài)的E coli M15。經(jīng)菌落PCR、雙酶切及測序鑒定，證明成功獲得轉(zhuǎn)化子PCB和PCM。用不同的誘導(dǎo)溫度，不同的誘導(dǎo)時間及不同的IPTG誘導(dǎo)濃度同時作用兩種重組菌PCB和PCM。經(jīng)SDS-PAGE和Westem-blotting檢測，結(jié)果表明，在任何誘導(dǎo)條件下，重組子PCB都沒有curcin2重組蛋白產(chǎn)生，而PCM都能表達出curcin2的重組蛋白，但主要以包函體形式存在。在本實驗