白木香離體根培養(yǎng)條件優(yōu)化及2-(2-苯乙基)色酮類物質(zhì)誘導(dǎo).pdf

1、沉香為瑞香科(Thymelaeaceae)沉香屬(Aquilaria)以及擬沉香屬(Gyrinops)喬木的樹脂心材，是貴重香料和傳統(tǒng)藥材，目前正面臨著野生資源枯竭和人工生產(chǎn)低效等問題。沉香主要含倍半萜和2-（2-苯乙基）色酮等特征成分，研究這些成分的代謝調(diào)控，有助于闡明沉香的形成機(jī)制。離體根培養(yǎng)體系已經(jīng)成功用于人參、丹參活性物質(zhì)的代謝途徑研究。效法成功案例，離體根培養(yǎng)體系可望成為研究沉香特征成分合成代謝的有效途徑。白木香(Aquila

2、ria sinensis(Lour.) Gilg)為國(guó)產(chǎn)沉香的唯一植物來源，其離體根系體系已有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬進(jìn)一步對(duì)離體根培養(yǎng)過程中的多個(gè)重要因素進(jìn)行系統(tǒng)考察，建立穩(wěn)定的培養(yǎng)體系，為后續(xù)研究沉香倍半萜和色酮類物質(zhì)的合成奠定基礎(chǔ)。
　　1目的:
　　本研究以白木香無菌苗根為供體材料，建立穩(wěn)定、高效的離體根培養(yǎng)體系;并進(jìn)行2-（2-苯乙基）色酮類結(jié)香標(biāo)志物的誘導(dǎo)。
　　2方法:
　　2.1優(yōu)化白木香離體根培養(yǎng)體系

3、
　　以白木香離體根為材料，分別考察生長(zhǎng)素的種類與濃度、生長(zhǎng)素處理時(shí)間、無機(jī)鹽濃度和初始接種量等對(duì)白木香離體根誘導(dǎo)生長(zhǎng)的影響，以出根率、側(cè)根密度和側(cè)根長(zhǎng)為指標(biāo)，篩選出最佳的白木香離體根培養(yǎng)體系。并在此基礎(chǔ)上，觀察單代白木香離體根生長(zhǎng)曲線變化情況。
　　2.2白木香離體根連續(xù)繼代培養(yǎng)考察
　　以白木香離體根為材料，在原有的培養(yǎng)條件上，觀察連續(xù)繼代對(duì)白木香離體根再生和側(cè)根生長(zhǎng)的影響;以出根率、側(cè)根密度和側(cè)根粗細(xì)為指標(biāo)，考察

4、白木香離體根連續(xù)培養(yǎng)的穩(wěn)定性。
　　2.3茉莉酸甲酯(MeJA)刺激白木香離體根實(shí)驗(yàn)
　　以培養(yǎng)了35d的白木香離體根為材料，用添加MeJA的培養(yǎng)基培養(yǎng)根系。通過觀察離體根系的再生率和側(cè)根生長(zhǎng)情況，觀察MeJA對(duì)白木香根系再生的影響。利用氣質(zhì)聯(lián)用色譜法(GC-MS)檢測(cè)其中色酮類物質(zhì)，考察MeJA濃度和處理時(shí)間對(duì)白木香根系產(chǎn)生色酮類物質(zhì)的影響。
　　3結(jié)果:
　　3.1白木香離體根培養(yǎng)體系
　　單因素法優(yōu)化

5、白木香離體根培養(yǎng)條件，結(jié)果表明:IBA1.5 mg/L誘導(dǎo)7d可生成大量生長(zhǎng)良好的側(cè)根;MS培養(yǎng)基減量濃度(1/4、1/2、3/4×MS)有利于側(cè)根誘導(dǎo)，正常濃度(1×MS)有利于側(cè)根生長(zhǎng);每瓶接種15根為最佳初始接種量。離體根發(fā)育進(jìn)程觀測(cè)結(jié)果表明，第6天多數(shù)離體根中形成側(cè)根原基，第9天少數(shù)離體根的側(cè)根原基發(fā)育突破主根表皮，隨后側(cè)根迅速生長(zhǎng)，離體根系干重增殖系數(shù)到第21天達(dá)到最大值，之后逐步下降。
　　3.2白木香離體根連續(xù)繼代培

6、養(yǎng)中根系再生情況
　　用水合氯醛浸泡白木香離體根24 h后觀察，可清晰觀察到離體根中的側(cè)根原基。研究結(jié)果表明，在連續(xù)6代培養(yǎng)中白木香離體根經(jīng)IBA誘導(dǎo)后側(cè)根原基的生長(zhǎng)曲線變化趨勢(shì)一致，但連續(xù)繼代會(huì)影響側(cè)根密度。白木香離體根再生能力在連續(xù)繼代培養(yǎng)過程中前3代側(cè)根密度保持穩(wěn)定，在第4代時(shí)側(cè)根密度迅速增加，在第5代又恢復(fù)到與前三代相同水平。最終各代主根段上可穩(wěn)定形成12-18條側(cè)根。此外，連續(xù)培養(yǎng)過程中側(cè)根直徑隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加而逐漸變

7、小。
　　3.3白木香離體根系對(duì)MeJA刺激的反應(yīng)
　　隨著MeJA濃度的升高，白木香離體根的生根率降低。不同濃度會(huì)對(duì)側(cè)根生長(zhǎng)有不同效應(yīng)，高濃度(400μmol/L)抑制白木香側(cè)根生長(zhǎng);中濃度(100、200μmol/L)會(huì)一定程度限制側(cè)根密度，促進(jìn)側(cè)根伸長(zhǎng);低濃度(50μmol/L)的MeJA刺激會(huì)使側(cè)根密度增多和促進(jìn)側(cè)根伸長(zhǎng)。
　　GC-MS結(jié)果表明，MeJA可誘導(dǎo)白木香離體根系產(chǎn)生2-（2-苯乙基）色酮類物質(zhì)。G

8、C-MS結(jié)果表明白木香根系產(chǎn)生2-（2-苯乙基）色酮類物質(zhì)的種類與外源MeJA處理濃度和處理時(shí)間呈正相關(guān)。隨著MeJA處理時(shí)間為(0、1、3、5、7d)的增加，可檢測(cè)到的2-（2-苯乙基）色酮類物種從0種到2種;隨著MeJA處理濃度（0、50、100、400μmol/L）的增加，可檢測(cè)的2-（2-苯乙基）色酮類物質(zhì)從1種到3種。
　　4.結(jié)論:
　　本研究?jī)?yōu)化了白木香離體根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件，明確了連續(xù)繼代根系的穩(wěn)定性，建立了一