低濃度H-,2-O-,2-促進(jìn)兔角膜培養(yǎng)上皮細(xì)胞黏附及移行的離體實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：細(xì)胞黏附及移行是角膜上皮創(chuàng)傷愈合的關(guān)鍵步驟，該過(guò)程依賴(lài)于整合素(integrin)及其配體纖維連接素(fibronectin)的信號(hào)作用系統(tǒng)。在細(xì)胞黏附于細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)程中，活性氧(Reaciveoxygenspecies，ROS)是整合素信號(hào)系統(tǒng)所必需的胞內(nèi)產(chǎn)物。本研究旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察外源性低濃度過(guò)氧化氫(hydrogenperoxide，H2O2)對(duì)兔培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞黏附及移行作用。 方法：采取新西蘭大白兔的角膜緣

2、作為原代細(xì)胞培養(yǎng)的組織片。除培養(yǎng)細(xì)胞外，本研究實(shí)驗(yàn)均使用無(wú)生長(zhǎng)因子以及無(wú)血清的培養(yǎng)液。四甲基偶氮比色(measurementoftrititaedthymidineincorporation，MTT)細(xì)胞活力測(cè)試法用于檢測(cè)外源性H2O2(0.1，5，10，20，50，60，和70μM)作用兔角膜上皮細(xì)胞2小時(shí)及24小時(shí)后的細(xì)胞活性。在適宜H2O2濃度范圍內(nèi)，黏附離心法用于測(cè)試黏附30和60分鐘后的細(xì)胞數(shù)量。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步用抗氧化劑N

3、-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)作為外源性H2O2拮抗藥，再測(cè)試黏附細(xì)胞的數(shù)量。選取最佳H2O2濃度組與非H2O2處理組，拍照記錄兩組細(xì)胞黏附15，30，以及60分鐘時(shí)的細(xì)胞形態(tài)，以比較兩組的變化差異。免疫熒光法被用于以上兩組細(xì)胞在30分鐘時(shí)的黏著斑蛋白(vinculin)，以及絲狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)表達(dá)的測(cè)定。離體創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)證明外源性低濃度H2O2對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞移行，以及創(chuàng)傷愈合的作用。

4、 結(jié)果：本研究的所有實(shí)驗(yàn)取用原代培養(yǎng)的兔角膜上皮細(xì)胞第2～3代。低于50μM的外源性H2O2作用細(xì)胞2小時(shí)及24小時(shí)，不降低細(xì)胞活性；而70μMH2O2則顯著性地下降細(xì)胞活性(p＜0.05)。黏附離心法結(jié)果顯示，低濃度H2O2對(duì)細(xì)胞黏附30和60分鐘時(shí)的促進(jìn)作用具有明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系：5～50μMH2O2顯著性地促進(jìn)細(xì)胞黏附(p＜0.05)，其中20μM是促進(jìn)的峰值；而60μMH2O2抑制細(xì)胞黏附(p＜0.08)；NAC可顯著性地拮抗2

5、0μMH2O2對(duì)細(xì)胞黏附的促進(jìn)作用(p＜0.05)。細(xì)胞黏附形態(tài)學(xué)觀察顯示20μMH2O2較0μMH2O2組的細(xì)胞更早表現(xiàn)出細(xì)胞邊緣波紋狀皺折，偽足伸出和梭形伸展的極性形態(tài)。免疫熒光法顯示在細(xì)胞黏附30分鐘時(shí)，20μMH2O2組細(xì)胞表達(dá)點(diǎn)狀的黏著斑蛋白，以及絲束狀肌動(dòng)蛋白；而未經(jīng)H2O2處理的細(xì)胞則尚未表達(dá)。離體兔角膜上皮創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)顯示：外源性低濃度H2O2(10μM～50μM)顯著性地促進(jìn)細(xì)胞移行和創(chuàng)傷愈合(p＜0.01)；其中20