2-氨基丁酸生產(chǎn)菌株構(gòu)建及發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、L-2-氨基丁酸是一種非天然氨基酸，在醫(yī)藥、化工領(lǐng)域有廣泛的應用，如左乙拉西坦和乙胺丁醇。本文以代謝工程理論為指導，以L-蘇氨酸高產(chǎn)菌E.coli THRD為出發(fā)菌株，構(gòu)建了生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的工程菌株。
　　將解除反饋抑制的蘇氨酸脫水酶基因ilvA4和ilvA過量表達于大腸桿菌THRD中，構(gòu)建成2-酮丁酸生產(chǎn)菌株THRD(p Trc99a-TPi lvA4)和THRD(p Trc99a-ilvA)。搖瓶補料發(fā)酵實驗結(jié)果顯示，T

2、HR D(p Trc99a-TPilvA4)和THRD(p Trc99a-ilvA)均能夠代謝L-蘇氨酸生成2-酮丁酸，產(chǎn)量為8.3±0.4g/L和9.23±0.31g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率分別為13.83％和15.38％，而對照菌則幾乎不積累2-酮丁酸。5L發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵結(jié)果顯示，THRD(p Trc99a-ilvA)可以積累2-酮丁酸18 g/L。ilvA分別與tyrB、GDH、bcdBS共表達，構(gòu)建了THRB、THRG2、THRG1

3、和THRL四株生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的工程菌。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，四株菌L-2-氨基丁酸的產(chǎn)量分別為4.07±0.16g/L、5.81±0.56g/L、8.99±1.1g/L和7.87±0.44g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率分別為6.78％、9.68％、14.98％和13.11％。5L發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵，THRL可以積累L-2-氨基丁酸19g/L，較THRG1展現(xiàn)出更大的潛力。上述結(jié)果證明，THRD蘇氨酸代謝途徑通過合理改造，可以高效生產(chǎn)L-2-氨基丁

4、酸。
　　大腸桿菌THRD可過量積累L-蘇氨酸，這與蘇氨酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)有很大的關(guān)系，改造L-蘇氨酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)可以減少L-蘇氨酸的過量分泌。通過敲除THRL中L-蘇氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因rhtA和rhtC，以減緩L-蘇氨酸向胞外的分泌。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，THRL△rhtA和THRL△rhtC的L-蘇氨酸濃度分別較原菌下降了47.03％和44.86％。與原菌相比，THRL△rhtA、THRL△rhtC的L-2-氨基丁酸產(chǎn)量分別提高了71.28％和

5、42.44％（13.48±0.84g/L、11.21±0.38g/L VS.7.87±0.44g/L）。5L發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果顯示，與原菌相比，THRL△rhtA、THRL△rhtC的L-2-氨基丁酸轉(zhuǎn)化率分別提高了10.42％和4.7％。然而，雙基因敲除菌THRL△rhtA△rhtC在減少了對L-蘇氨酸積累的同時，減少了對L-2-氨基丁酸的積累。上述結(jié)果證明，適當?shù)馗脑霯-蘇氨酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，有利于L-2-氨基丁酸的積累，而分泌蛋白基因雙敲除

6、則不利于L-2-氨基丁酸的積累。
　　菌株THRL中引入源于M.jannaschii的檸蘋酸途徑，構(gòu)建了L-2-氨基丁酸的雙代謝途徑菌株THRLC1和THRLC2。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，與對照菌相比，THRLC1和THRLC2積累2-酮丁酸的變化不明顯，L-2-氨基丁酸的產(chǎn)量分別提高29.23％和34.77％。實驗結(jié)果說明，菌株通過雙代謝途徑的協(xié)同互補作用，有利于積累L-2-氨基丁酸。相較于蘇氨酸單代謝途徑，檸蘋酸途徑的引入提高了L-