22例戈謝病患者GBA基因突變分析及新突變的功能學研究.pdf

1、背景：
　　戈謝?。℅aucher Disease，OMIM606463）是一種相對常見的溶酶體貯積病，呈常染色體隱性遺傳。是由于GBA基因發(fā)生突變引起溶酶體內β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，GBA，EC3.2.1.45）活性顯著降低或缺乏而致病。β-葡萄糖苷酶的作用是將底物葡萄糖腦苷脂水解成葡萄糖和神經酰胺，當該酶活性降低或缺乏時，大量的底物沉積于溶酶體內，造成多器官的損傷，主要表現為肝脾腫大、骨病和神經系統癥狀。戈

2、謝病的臨床表現輕重差異較大，輕者可無癥狀，重者可在圍產期致死。根據神經系統是否受累，戈謝病的臨床表型可分為3種：I型（非神經型/慢性型）、II型（急性神經型/神經型）、III型（亞急性神經型/神經型）。在猶太人群戈謝病患者中，I型最為常見，各個年齡段均可發(fā)病，多在學齡前兒童發(fā)病，沒有神經系統受累的表現；II型戈謝病常在嬰兒期發(fā)病，病情嚴重，可表現為迅速進展的癲癇發(fā)作、角弓反張等神經系統癥狀，可在2歲前死亡；III型戈謝病早期表現為臟器的

3、損傷，后逐漸出現神經系統癥狀。戈謝病在世界各地均有發(fā)病，但其發(fā)病率具有明顯的種族差異性。據估計，戈謝病在普通人群中的發(fā)病率為1/50,000-1/100,000，在猶太人群中的發(fā)病率最高，為1/500-1/1,000。
　　外周血白細胞或培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞GBA酶活性的檢測是診斷戈謝病的金標準。當外周血白細胞或皮膚成纖維細胞中GBA酶活性明顯降低至正常均值的30％以下時，即可診斷為戈謝病。隨著檢測技術的提高，以干血片為載體的GB

4、A酶學測定在戈謝病的篩查及診斷中逐漸普及應用，為新生兒及高危戈謝病患者的篩查提供基礎。此外，GBA基因突變分析可從分子水平進一步確診戈謝病。
　　GBA基因跨度7.6kb，位于1q21，有11個外顯子，10個內含子，轉錄一條長2387bp的mRNA，開放閱讀框為1611bp，編碼536個氨基酸的多肽鏈。在同一染色體距 GBA基因下游16kb的位置，存在一個跨度5.5kb，同源性達96%的假基因（GBAP），真假基因可發(fā)生同源重組導

5、致致病突變產生。根據人類基因突變數據庫HGMD（Professional2016.2）報道，GBA基因突變共437種，包括點突變、剪接突變、小缺失小插入突變、基因重排，其中以點突變最常見，約占75.7%。GBA基因的突變譜存在種族及地域的差異，在猶太人群及高加索人群戈謝病患者中，N370S、84GG、L444P、IVS2+1G>A這4種突變最為常見，分別占戈謝病患者GBA基因突變的97%及75%。而在亞洲人群戈謝病患者中，L444P、F

6、213I、RecNciI這3種突變最為常見。
　　戈謝病臨床表型與基因型間的關系尚未十分明確。N370S和N188S突變與I型戈謝病有關，L444P/RecNciI基因型與II型戈謝病有關，L444P純合型突變與III型戈謝病有關。戈謝病臨床表型與基因型間的關系的研究，可為患者的疾病預后評估、治療和遺傳咨詢提供幫助。
　　戈謝病的特異性治療方法有酶替代療法、底物減少療法、分子伴侶治療法、造血干細胞移植治療、基因治療。酶替代治

7、療是臨床采用的主要治療方法。目前，在我國上市的藥品是注射用的伊米苷酶（Imiglucerase），酶替代治療能顯著改善患者的臨床癥狀，提高患者的生活質量，只對未涉及神經病變的I型戈謝病有效，但不能預防或改善中樞神經系統損傷，且治療費用昂貴，普及率不高；底物減少法治療在美國已經批準上市的藥物有美格魯特（Miglustat, Zavesca），它是一種對I型戈謝病患者有效的口服藥，雖然可透過血腦屏障，但臨床上并沒有觀察到它對II型及III型

8、戈謝病患者有效；近幾年學者對分子伴侶治療方法的研究較多，研究發(fā)現分子伴侶藥物不僅能有效改善患者的臨床癥狀，而且對神經系統癥狀有改善作用，因為該藥物可以穿過血腦屏障，是目前解決戈謝病神經組織病變問題最有前景的治療方法。研究表明，針對不同的突變，分子伴侶藥物的治療效果不同，如脫氧野尻霉素類藥物可使N370S突變的GBA酶活性提高至6.2倍，而IFG類藥物可使L444P突變的GBA酶活性提高至3.5倍。因此，尋找針對不同突變的最合適的分子伴侶

9、藥物是目前戈謝病藥物治療研究的突破點。造血干細胞移植治療風險較大，國際上對該治療方法報道極少?；蛑委熑栽趧游镅芯侩A段。
　　對于戈謝病GBA基因突變特點的了解，多數來自于歐洲和美國等國外學者的文獻報道，除韓國和日本學者對戈謝病GBA基因突變特點進行了報道，其它亞洲地區(qū)的國家對戈謝病的研究報道較少，我國對戈謝病的相關研究也非常缺乏。自1985年Sorge等成功克隆出人類GBA基因cDNA片段以來，科學家不斷深入探索了 GBA基因突

10、變對蛋白酶結構和功能的改變及突變蛋白加工修飾過程中的異常。我國對戈謝病的分子發(fā)病致病機制的研究較晚，新突變的功能學驗證資料更是少見。因此，分析戈謝病患者GBA基因突變特點，對新突變致病性進行功能學驗證，探討戈謝病患者臨床表型與基因型間的關系是十分有意義的。
　　目的：
　　分析22例中國戈謝病患者GBA基因的突變特點，對GBA基因新突變進行體外功能學鑒定，并探討戈謝病臨床表型與基因型間的關系。
　　方法：
　　2

11、010年1月至2015年12月廣州市婦女兒童醫(yī)療中心內分泌與遺傳代謝科根據外周血白細胞GBA酶活性檢測確診戈謝病患兒共22例，來自中國南方地區(qū)（廣東省、湖南省、江西省、貴州省），均無血緣關系，其中男15例，女7例。提取患者外周血基因組DNA，采用巢式PCR的方法對GBA基因的11個外顯子及外顯子兩端的側翼序列進行基因突變分析，對新突變進行多物種突變氨基酸的保守性分析，并利用 SIFT及 Polyphen-2軟件預測新突變的致病性，利用人

12、GBA蛋白晶體結構同源建模，使用PyMOL及Discovery Studio軟件標記突變位點在蛋白三維結構中的位置及分析其對蛋白結構的影響。建立GBA基因體外真核表達體系，把pcDNA3.1-EGFP作為空載體，構建pcDNA3.1-GBA-EGFP野生型載體，然后再體外定點誘變成相應的突變型載體，轉染COS-7細胞后提取細胞總蛋白，采用熒光法對GBA酶活性及參考酶β-半乳糖苷酶活性進行檢測，并進行Western blot蛋白印跡分析，

13、對新突變進行功能學驗證。通過結合基因突變特點及患者臨床信息，探討戈謝病患者臨床表型與基因型間的關系。
　　結果：
　　1.本研究22例戈謝病患者的診斷年齡5個月-69歲，<3歲的患者占63.6%（13/22）?；颊叩耐庵苎准毎鸊BA酶活性明顯降低，為2.05±1.49 nmol/mg/h，除4例戈謝病患者的殼三糖苷酶活性為0 nmol/ml/h，其余患者的殼三糖苷酶活性均顯著升高，為5916.93±4635.75 nmol

14、/mg/h。22例戈謝病患者中，I型19例，II型3例，沒有發(fā)現III型患者。I型患者中，63%（12/19）的患者在2歲內起病，且表現為嚴重的脾大，貧血、血小板降低等，26%（5/19）的患者3歲前死亡。II型患者均在嬰兒期發(fā)病，2歲前死亡。本研究有6例基因型為L444P/L444P的I型患者，早期發(fā)病，病情嚴重；有9例基因型為L444P復合雜合型的I型患者，其臨床表現存在輕重差異；有2例基因型均為L444P/RecNciI患者，臨床

15、分型均為II型。
　　2.本研究的44個GBA等位基因均檢測出（檢出率為100%），共檢出18種不同的突變，包括14種已知致病突變（F37V、L96P、R120W、M123V、L264I、R359Q、Y363C、V375L、D409H、L444P、R496C、RecNciI、IVS2+1G>A、IVS6-1G>C）和4種新突變（Y22C、F109L、L149F、c.983_990delCCCACTGG）。突變L444P最常見，突變

16、率為47.7%，其次為RecNciI(6.8%)。新錯義突變Y22C、F109L、L149F及功能未知的已報道突變L96P的突變氨基酸在12個不同物種中高度保守，且SIFT評分均接近0，Polyphen-2評分均接近1。GBA蛋白結構分析提示 Y22C突變可使糖基化位點 N19附近的蛋白空間結構發(fā)生改變；L96P、F109L、L149F突變位點均位于催化區(qū)域，可影響蛋白催化結構的形成。
　　3.空載體、野生型及突變型載體轉染COS

17、-7細胞72小時后，熒光顯微鏡觀察可見各組細胞均顯示明亮綠色熒光，Y22C、L96P、F109L、L149F突變型載體表達GBA酶活性明顯降低。Western blot蛋白印跡分析結果提示，Y22C、L96P、F109L、L149F突變型載體GBA蛋白表達量均有不同程度的減少。
　　結論：
　　1.本研究豐富了GBA基因的突變譜。通過GBA基因分析，本研究共檢測出18種不同的突變，其中有4種新突變（Y22C、F109L、L1

18、49F、c.983_990delCCCACTGG）。L444P為熱點突變，突變率為47.7%，其次為RecNciI(6.8%)。
　　2.構建了GBA基因體外真核表達載體，經COS-7細胞瞬時表達實驗驗證，新突變Y22C、F109L、L149F為致病性突變，同時為新突變功能學研究及分子致病機制提供基礎。
　　3.本研究發(fā)現L444P純合型患者與重癥的I型戈謝病有關。L444P復合雜合型患者臨床癥狀的嚴重程度常與其攜帶的另一個