阿爾茨海默病患者presenilin-1基因突變篩查及其起始密碼子突變后表達(dá)的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　 阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是一種進(jìn)行性不可逆神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，是老年癡呆最常見(jiàn)的病因。至今AD的確切病因和發(fā)病機(jī)制不明，目前已知載脂蛋白Eε4等位基因與遲發(fā)性AD相關(guān)，早發(fā)性家族性AD主要由β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloidprecursorprotein，βAPP)、早老素-1(presenilin-1，PS-1)及早老素-2(presenilin-2，PS-2)基因突變引

2、起。目前對(duì)于PS-1基因突變?nèi)绾沃虏∵€不清楚，之前的研究認(rèn)為突變的PS-1通過(guò)“獲得功能”(gainoffunction)影響β-淀粉樣多肽1-42(Amyloidβ1-42，Aβ42)而發(fā)病，即淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō)(AmyloidCascadeHypothesis)，該假說(shuō)認(rèn)為異常的β淀粉樣蛋白(amyloid-βpeptides，Aβ)是觸發(fā)病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)并最終導(dǎo)致AD的第一步。Aβ是由正常存在于細(xì)胞膜上的APP經(jīng)β-和γ-分泌酶剪切后

3、產(chǎn)生一系列長(zhǎng)度在39～43個(gè)氨基酸的短肽，其中，Aβ42最容易聚集纖維化，是主要的致病蛋白。早老素(presenilin，PS)蛋白是γ-分泌酶復(fù)合物的活性亞基，如發(fā)生突變，可影響APP剪切而導(dǎo)致異常Aβ的產(chǎn)生和聚集。近期的研究發(fā)現(xiàn)，某些PS-1基因突變不通過(guò)Aβ42致病。因此，需要更多的研究參與闡述PS-1基因突變與AD的關(guān)系。
　　 目的：
　　 通過(guò)篩查突變頻率最高的PS-1基因突變來(lái)觀察111例來(lái)自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院

4、附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院或門診被診斷為AD的患者并且未經(jīng)家族史和發(fā)病年齡篩選的情況下PS-1基因的突變情況。篩查發(fā)現(xiàn)1例患者PS-1基因3號(hào)外顯子起始密碼子發(fā)生了雜合突變ATG→GTG，構(gòu)建突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞觀察PS-1起始密碼子突變后PS-1和APP的表達(dá)變化情況。
　　 方法：
　　 研究對(duì)象共266例包括未經(jīng)過(guò)家族史和發(fā)病年齡篩選的111例來(lái)自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院或門診被診斷為AD的患者，5例M7

5、66患者親屬，150例正常對(duì)照。常規(guī)酚/氯仿提取法提取外周血DNA，對(duì)PS-1基因13個(gè)外顯子及側(cè)翼內(nèi)含子DNA擴(kuò)增，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)產(chǎn)物純化后直接測(cè)序分析。利用體外定點(diǎn)突變技術(shù)突變野生型PS-1cDNA并構(gòu)建野生型和突變型PS-1增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)融合基因質(zhì)粒，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PS-1和APP基因

6、在人胚胎腎(HEK)293細(xì)胞、小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞N2a中的mRNA表達(dá)情況，并通過(guò)Westernblot技術(shù)觀察野生型和突變型PS-1蛋白在兩個(gè)細(xì)胞系中的表達(dá)變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 (1)發(fā)現(xiàn)患者M(jìn)766的PS-1基因3號(hào)外顯子起始密碼子發(fā)生了雜合突變ATG→GTG。該患者的發(fā)病年齡為57歲。其93歲母親、63歲的大妹妹和患者的小兒子也檢測(cè)到同樣的突變，但均未發(fā)病。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)已報(bào)道的單核苷酸多態(tài)(Single

7、NucleotidePolymorphisms，SNP)(rs1800839，rs116882898，rs165932)。
　　 (2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PS-1基因mRNA在HEK293細(xì)胞和N2a細(xì)胞中野生型均顯著高于突變型，APP基因mRNA在兩細(xì)胞系中未見(jiàn)明顯差異。
　　 (3)Westernblot結(jié)果顯示野生型和突變型PS-1在HEK293細(xì)胞中均表達(dá)，且突變型表達(dá)量較野生型少。而N2a細(xì)胞僅表達(dá)野生

8、型PS-1。
　　 結(jié)論：
　　 (1)對(duì)未經(jīng)過(guò)家族史和發(fā)病年齡篩選的111例來(lái)自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院或門診被診斷為AD的患者行PS-1基因突變篩查未發(fā)現(xiàn)新的或已經(jīng)報(bào)道的致病突變，提示PS-1基因突變導(dǎo)致的AD占總AD患者比例較低。
　　 (2)根據(jù)M766患者家系圖顯示，未見(jiàn)PS-1基因起始密碼子突變和疾病AD共分離現(xiàn)象，推測(cè)其可能不是致病突變，而是AD的一個(gè)危險(xiǎn)因素，也可能是一個(gè)SNP。

9、r>　　 (3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PS-1基因mRNA在HEK293細(xì)胞和N2a細(xì)胞中野生型均顯著高于突變型，Westernblot技術(shù)檢測(cè)PS-1蛋白表達(dá)顯示野生型和突變型PS-1在HEK293細(xì)胞中均表達(dá)，且突變型表達(dá)量較野生型少。而N2a細(xì)胞僅表達(dá)野生型PS-1，提示PS-1基因非ATG起始密碼子GTG在HEK293細(xì)胞中表達(dá)效率降低，而在神經(jīng)樣細(xì)胞N2a中可能引起PS-1蛋白不表達(dá)。
　　 (4)實(shí)時(shí)熒光定量P