31例B型血友病患者FⅨ基因突變研究.pdf

1、背景與目的:
　　 血友病(Hemophilia)是一組由于血液中某些凝血因子的缺陷而導(dǎo)致患者產(chǎn)生嚴(yán)重凝血障礙的遺傳性出血性疾病，男女均可發(fā)病，但絕大部分為男性。主要分型為A型血友病（甲型血友?。型血友?。ㄒ倚脱巡。?、因子Ⅺ缺乏癥（曾稱丙型血友病）和其他因子缺乏癥。血友病在先天性出血性疾病中最為常見，出血是該病的主要臨床表現(xiàn)。而臨床上最常見的血友病有A型血友病(hemophiliaA，HA)和B型血友病(hemophili

2、a B，HB)兩型，分別是由于凝血因子Ⅷ(FⅧ)和凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因缺陷所引起，均為X連鎖隱性遺傳。在男性血友病患者中，HA占80％～85％，而HB僅占15％～20％，且HB在男性中的發(fā)病率大約為1/30000，遠(yuǎn)低于HA，女性患者更是罕見。目前血友病的主要治療方案為向機(jī)體內(nèi)補(bǔ)充凝血因子等血漿替代療法來預(yù)防或控制血友病出血癥狀。由于血友病是一種遺傳性疾病，必須針對其對應(yīng)基因進(jìn)行治療，才有可能根治。因此，有必要對該病的基因突變類型進(jìn)行

3、進(jìn)一步的研究分析，從而建立起有效的基因診斷體系，為基因治療提供重要的依據(jù)。
　　 B型血友病，又稱Christmas Disease，機(jī)制為FⅨ基因缺陷導(dǎo)致血漿中FⅨ含量減少或功能異常使凝血因子的凝血活性降低或缺失，從而形成嚴(yán)重的凝血功能障礙。臨床上根據(jù)凝血因子Ⅸ活性可分為輕型(5％＜FⅨ:C＜40％)、中型(5％＜FⅨ:C＜1％)和重型(FⅨ:C＜1％)。1985年，Yoshitake等人完成了FⅨ基因的全序列分析?？芍?，F(xiàn)Ⅸ

4、基因的長度為33.5kb，由8個外顯子和7個內(nèi)含子以及側(cè)翼序列組成，其8個外顯子對應(yīng)編碼FⅨ蛋白的6個結(jié)構(gòu)域。1990年George Brownlee首次建立了HB基因突變數(shù)據(jù)庫。目前最新發(fā)布的FⅨMutation Database（第12版）共收錄了2891例病人，涵蓋了包括91例大缺失或插入在內(nèi)的962種惟一突變。隨著世界范圍對HB研究的深入和HB患者被發(fā)現(xiàn)病例數(shù)的增加，突變數(shù)據(jù)庫正在不斷更新，新的突變正被人們所發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識。根據(jù)數(shù)據(jù)

5、庫內(nèi)，突變在基因內(nèi)蛋白區(qū)域和控制區(qū)域的分布顯示，F(xiàn)Ⅸ基因的突變具有明顯的高度的異質(zhì)性，可發(fā)生在FⅨ基因外顯子、內(nèi)含子、啟動子及其側(cè)翼序列的任何位置。已知的FⅨ基因突變類型包括錯義突變、無義突變、小的插入和缺失等，其中錯義突變占60％以上。
　　 當(dāng)前，HB及攜帶者的基因診斷方法大致可為間接法和直接法兩大類。對具有明確家族史和先證者的家系，可聯(lián)合多個STR多態(tài)性位點(diǎn)，采用限制性片段長度多態(tài)性(RFLPs)、短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)

6、和單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(SNP)等間接基因診斷方法對HB進(jìn)行基因診斷。用PCR擴(kuò)增目的基因，然后進(jìn)行異源雙鏈分析的直接診斷方法有變性梯度凝膠法( DGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)等。對于無家族史或先證者的散發(fā)HB病例和攜帶者進(jìn)行基因診斷和產(chǎn)前診斷，即使利用多態(tài)性位點(diǎn)的連鎖分析方式也會出現(xiàn)無法診斷的現(xiàn)象。當(dāng)運(yùn)用SSCP、DGGE等直接檢測方法發(fā)現(xiàn)有異常時，仍需要進(jìn)一步進(jìn)行基因序列分析以確定具體突變，且SSCP等方法都存在復(fù)雜費(fèi)時且敏感

7、性低等問題。近年來，隨著PCR技術(shù)的不斷成熟及FⅨ基因較小及其他相關(guān)因素等原因，國內(nèi)外許多研究組對HB患者的基因診斷采用全基因測序的方法取代他法，均取得了較好的結(jié)果。本研究在文獻(xiàn)資料及其他研究基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)合成了覆蓋FⅨ基因8個外顯子及其側(cè)翼序列在內(nèi)的8對引物，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及DNA測序技術(shù)對31例HB患者進(jìn)行FⅨ基因突變檢測，并通過Chromas軟件在Blast上將測序結(jié)果與正常序列進(jìn)行比對，尋找到基因突變具體位置。
　

8、　 將研究收集的所有HB患者FⅨ基因直接測序所得的基因突變結(jié)果進(jìn)行分析，得出突變具體位置、類型、氨基酸改變。31例患者基因突變檢測及分析，對于明確FⅨ基因突變機(jī)制有重要意義，為基因治療的發(fā)展提供了分子依據(jù)，同時也為世界HB突變數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了必要的補(bǔ)充，是世界范圍對HB研究的重要組成部分。
　　 材料與方法:
　　 1.研究對象
　　 來自南方醫(yī)院血液科及婦產(chǎn)科門診，31個無親緣關(guān)系HB家系中的31例HB患者，臨床

9、均有不同程度的出血現(xiàn)象，且所有患者的FⅨ活性(factorⅨactivity，F(xiàn)Ⅸ:C)測定均＜5％。
　　 2.標(biāo)本采集及DNA提取
　　 靜脈采集HB患者外周血2 ml，以乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraaceticacid，EDTA)進(jìn)行抗凝。實(shí)驗(yàn)室中，用外周血DNA提取試劑盒（美國Life公司）提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 3.引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增
　　 根

10、據(jù)FⅨ基因序列(Gene Bank K02402)，參照相應(yīng)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)并合成8對引物，8對引物覆蓋FⅨ基因的外顯子全部區(qū)域及其側(cè)翼序列，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。
　　 PCR反應(yīng)總體積為50μl，加入上游和下游引物各5pmol（終濃度為0.1μM），四種dNTP各5nmol(終濃度為0.1 mM)，5μl10×Taq PCR Buffer(100mM Tris-HCl，15mM MgCl2和500mM KCl，pH8.

11、3)，2U Taq DNA聚合酶（TAKARA公司），基因組DNA50-200ng。所有PCR擴(kuò)增反應(yīng)在美國PE公司的9700型熱循環(huán)儀上進(jìn)行。本研究設(shè)計(jì)的針對8對引物的PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5min;30個PCR循環(huán)中，94℃變性30sec，59℃退火30sec，72℃延伸1min;最后在72℃延伸10min。
　　 4.PCR產(chǎn)物電泳和測序
　　 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μl與1μl上樣緩沖液混勻，在溴乙錠染色(EB

12、)的1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析，電壓80V，時間20分鐘，以鑒定PCR擴(kuò)增的特異性。符合測序條件的PCR產(chǎn)物送測，PCR產(chǎn)物純化及測序工作由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。利用Chromas及Blast等生物軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果與討論:
　　 1.結(jié)果
　　 通過Chromas軟件在Blast上將測序結(jié)果與正常序列進(jìn)行比對，31例HB患者通過DNA直接測序均檢測到了突變位點(diǎn)。查閱相關(guān)文獻(xiàn)及突變數(shù)據(jù)

13、庫資料，分析檢測結(jié)果顯示，本研究的31例樣本中FⅨ基因的突變位點(diǎn)分散無熱點(diǎn)區(qū)，突變類型多樣，有點(diǎn)突變、插入和缺失等。突變中多數(shù)為點(diǎn)突變，在缺失突變中有1例全基因缺失，其他均為小片段缺失。31例患者共發(fā)現(xiàn)了34種突變，其中1例為三重突變，6例為雙重突變，此外還發(fā)現(xiàn)13種新突變，為國際上首次報(bào)道。
　　 2.討論
　　 到目前為止，F(xiàn)Ⅸ基因及其蛋白結(jié)構(gòu)和功能已研究得非常清楚。FⅨ基因定位于Xq27.1，基因全長約33.5kb

14、，由8個外顯子、7個內(nèi)含子及其側(cè)翼序列中的調(diào)控區(qū)所組成。HB基因突變類型種類繁多，以點(diǎn)突變、短片段的缺失(少于30bp)和插入突變多見，其中80％左右為單個堿基的突變。不同于HA，HB的散發(fā)率可達(dá)30％-50％。1990年首次建立了HB突變數(shù)據(jù)庫。隨著病例數(shù)目的積累，新的缺陷正不斷地被發(fā)現(xiàn)。從已報(bào)道的突變分布看，包括polyA信號區(qū)域在內(nèi)的FⅨ基因所有區(qū)域均有突變發(fā)生，且突變具有明顯的異質(zhì)性。
　　 整體上，本研究共發(fā)現(xiàn)的31例

15、患者除外6例為缺失突變（1例全基因缺失和5例短片段缺失），其余均為點(diǎn)突變，占80.6％，說明了點(diǎn)突變是最常見的突變類型。其次，HB突變數(shù)據(jù)庫顯示突變在8個外顯子的分布情況也不同。由于編碼與Ca2+結(jié)合的EGF區(qū)及催化區(qū)，外顯子4和8的突變發(fā)生率較高。本研究雖只有31例患者，一共有11例發(fā)生于外顯子4和8，占35.5％。而外顯子1、6、7中突變較少，占16.1％。
　　 CpG雙核苷酸區(qū)域被認(rèn)為是突變熱點(diǎn)，劉敬忠等采用PCR法和G

16、AWTS技術(shù)也進(jìn)一步證實(shí)了CpG確系突變熱點(diǎn)，主要是C→T/A。本研究中有7例發(fā)生在CpG熱點(diǎn)上，類型為C→T，G→A和G→T，占22.6％，又一次證明了CpG雙核苷酸的突變熱點(diǎn)區(qū)域。
　　 Toyozumi等確定了內(nèi)含子1的第192核苷酸(FⅨ192)為二核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，存在于正常日本人中。王寧遂等發(fā)現(xiàn)并計(jì)算出中國人FⅨ-192A和G的基因頻率分別為0.81和0.19。本研究中發(fā)現(xiàn)有4例患者在此處發(fā)生突變，進(jìn)一步驗(yàn)證了該基因

17、此位置的多態(tài)性位點(diǎn)。與此同時，其中2例HB患者所有外顯子及剪切部位只發(fā)現(xiàn)了此處惟一的突變點(diǎn)即多態(tài)性位點(diǎn)，患者本身確診為HB，有理由懷疑其致病突變?yōu)樵谖礈y序范圍的內(nèi)含子區(qū)域。因此，需要另外擴(kuò)增覆蓋7個內(nèi)含子大片段區(qū)域和3'不翻譯區(qū)域的序列，進(jìn)行DNA測序以確定基因突變位置。
　　 經(jīng)過最新HB突變數(shù)據(jù)庫查詢，本研究共發(fā)現(xiàn)13種新突變，為國際上首次報(bào)道。其中4種為發(fā)生在外顯子的錯義突變，氨基酸改變分別為L-Q、Y-D、S-P和V-G

18、。氨基酸改變導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變從而引起蛋白質(zhì)功能的降低或缺失，引起凝血功能的障礙，導(dǎo)致了血友病的發(fā)生。缺失類型方面，除-T為已報(bào)道的導(dǎo)致閱讀框架移改變的缺失突變外，其余3種均為新發(fā)現(xiàn)的缺失類型，其中-GCTGAAACCA和-GCTAAACA為發(fā)生在外顯子部位引起閱讀框架改變的缺失突變，-ATTT為剪接位點(diǎn)缺失。剪切位點(diǎn)是外顯子與外顯子銜接重要部位，此位置的基因改變會導(dǎo)致銜接過程受阻，引起無法正常剪切或剪切改變，最終引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)跟

19、功能異常，導(dǎo)致凝血障礙。此外，T6320A、C6828T、G6640A、A29753G、G30321T和T17517G等6種堿基突變發(fā)生于外顯子以外的序列位置。比對內(nèi)含子/外顯子剪接堿基序列，已知6320堿基屬于剪切位置，可確定T6320A為引起剪接改變的致病突變。其余5種突變不在剪切位置，是否為一種新的多態(tài)性或者為致病突變，則需要進(jìn)一步的研究。
　　 相對于HA，HB較為少見，人群發(fā)病率只有1/30000。而我國是發(fā)展中國家，

20、人們對疾病的認(rèn)識相較于發(fā)達(dá)國家有很大的差距，HB患者無法得到確診和救治，就醫(yī)患者數(shù)目極少。國內(nèi)關(guān)于HB的研究機(jī)構(gòu)及人員也屬于少數(shù)群體，關(guān)于中國人HB的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相當(dāng)有限。雖然國際上已經(jīng)建立了HB突變數(shù)據(jù)庫，但是包含的病例數(shù)也只有幾千例，而HB的基因突變呈現(xiàn)多樣性，且HB散發(fā)率也高。鑒于HB有限的研究資源，本研究通過對31例HB患者FⅨ基因進(jìn)行的基因突變分析，對攜帶者基因突變篩查及產(chǎn)前基因診斷具有指導(dǎo)意義。而FⅨ基因的新突變的發(fā)現(xiàn)，在豐

21、富突變譜同時，不僅有助于進(jìn)一步了解FⅨ基因中某些氨基酸殘基對于FⅨ凝血活性的重要性，明確致病機(jī)制，也為以后的基因治療提供了科學(xué)依據(jù)。
　　 結(jié)論:
　　 1.CpG雙核苷酸區(qū)域是突變熱點(diǎn)。
　　 2.我國人群中，內(nèi)含子1的第192核苷酸(FⅨ192)為二核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。
　　 3.發(fā)生在外顯子區(qū)域的點(diǎn)突變、缺失和插入等導(dǎo)致氨基酸改變或提前終止可確定為致病突變。剪接位置的突變也確定為致病突變。