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文檔簡介
1、第一部分人親磷酸酯酶A1基因的克隆及序列分析
目的: 克隆人親磷酸酯酶A1(phosphatidic acid-preferring phospholipase A1,PA-PLA1)基因,獲mRNA全長序列,并通過分析所編碼氨基酸的序列特征為從分子水平上研究PA-PLA1生理功能提供理論依據(jù)。
方法: 從人的肝臟組織中提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴(kuò)增該基因片段,cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增該基因末端,克隆測
2、序后獲得PA-PLA1基因mRNA全長序列。Vector NTI8.0拼接序列并進(jìn)行序列比對,DNASTAR構(gòu)建系統(tǒng)樹。登錄NCBI用人類基因組數(shù)據(jù)庫做BLAST分析,ORF finder預(yù)測PA-PLA1的編碼框。
結(jié)果: PA-PLA1基因mRNA全長為2923bp,編碼區(qū)長2238bp,編碼一個由745個氨基酸殘基組成的蛋白多肽,分子量為83141道爾頓,等電點(diǎn)為5.64。全序列與人脂肪酶家族序列差異較大,與具有膜泡運(yùn)輸
3、功能的KIAA0725蛋白及P125蛋白具一定同源性。氨基酸序列中具有與酶活性相關(guān)的保守序列Ser408-His-Ser410-Leu-Gly412,Glu448-Ala475區(qū)可形成卷曲螺旋區(qū)域,且N末端可形成DDHD結(jié)構(gòu)域。
結(jié)論: 成功克隆人PA-PLA1基因(NCBI GeneBank序列號為DQ315474)。序列分析研究顯示人PA-PLA1的功能可能與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)有關(guān)。
第二部分 PA-PLA1基因表達(dá)
4、與胰島素分泌關(guān)系的初步研究
目的: 研究PA-PLA1基因在小鼠胰島β細(xì)胞株MIN6中的表達(dá)與胰島素分泌的關(guān)系。
方法: 以不同濃度及不同時間分別對MIN6細(xì)胞行葡萄糖刺激胰島素分泌實(shí)驗(yàn),放免法測定細(xì)胞上清液中胰島素分泌量,實(shí)時熒光定量PCR檢測相應(yīng)條件下PA-PLA1 mRNA的表達(dá)水平,線性相關(guān)分析PA-PLA1 mRNA表達(dá)水平與胰島素分泌的相關(guān)性。
結(jié)果: 在一定葡萄糖濃度范圍內(nèi),PA-PLA1 m
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