SY1磷酸酶基因的原核表達(dá)及其單克隆抗體的初步制備.pdf

1、目的：利用含有人的SY1的pBluescriptR質(zhì)粒，構(gòu)建重組體，并用重組體轉(zhuǎn)染原核細(xì)胞表達(dá)含SY1的融合蛋白，以此融合蛋白為抗原免疫Balb/c小鼠，制備單克隆抗體，為將來進(jìn)一步研究該基因的功能打好基礎(chǔ)。 方法：用PCR擴(kuò)增SY1的cds序列，限制性內(nèi)切酶酶切，構(gòu)建到pET28a(+)中，酶切、測序等鑒定后，重組體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，在變性條件下經(jīng)Ni2+-NTA凝膠親和層析純化目的蛋白。WesternB

2、lot方法檢測重組蛋白的表達(dá)，用純化的SY1蛋白作為抗原免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞，采用常規(guī)雜交瘤技術(shù)方法制備雜交瘤細(xì)胞，克隆化篩選陽性細(xì)胞克隆，制備單克隆抗體。間接ELISA試驗(yàn)鑒定單克隆抗體并檢測單克隆抗體的效價(jià)。 結(jié)果：成功構(gòu)建出pET28a(+)-SY1重組質(zhì)粒，SDS-PAGE顯示SY1融合蛋白在大腸桿菌中主要以包涵體形式存在，WesternBlot方法檢測到融合蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有相對(duì)分子量為41KD的特異