人基因組隨機MARs的分離、克隆及其功能的初步研究.pdf

1、背景與目的:隨著人類基因組序列草圖的完成，基因組學研究的廣泛開展，基因表達調控研究已經逐漸從單個基因點、線式的調控拓展到立體層面上多基因、基因簇以至整個基因組的調控網(wǎng)絡。在遺傳調控過程中，反式作用因子與順式作用元件間的相互作用是構成基因表達調控網(wǎng)絡的基礎。核基質附著區(qū)(Matrixattachmentregions，MARs)是真核生物染色質中可以與核基質(Nuclearmatrix，NM)蛋白結合的一段DNA序列。它能使染色質形成環(huán)狀

2、結構，并與真核基因組中其它調控元件以及反式作用因子一起調節(jié)DNA復制、RNA合成和hnRNA加工等過程，在基因表達調控中起重要作用。此外，在基因工程研究中，引入MAR能消除外源基因對整合位點的敏感性，從而消除插入位點周圍調控元件的影響，提高轉染細胞外源基因表達的效率和穩(wěn)定性，為克服轉基因沉默或基因治療提供新的途徑。目前S/MARtDB庫中，人源的MARs僅有117個，其功能尚未全知，而人類基因組中大量的MARs有待深入研究。因此，本研究

3、擬從人基因組中分離隨機的MARs元件，構建成隨機MARs庫；利用體外結合實驗篩選出具有MARs特性的序列，并進行測序和相關生物信息學分析，預測人MARs可能具有的功能結構。為進一步探討MARs在人基因組中的功能意義，深入認識真核生物基因表達調控機制提供新的理論依據(jù)。 實驗方法:利用MARs與核基質結合后拮抗高鹽和DNA酶作用的特性，從人T細胞株CD3+-Jurkat細胞中分離MARs。 將MARs平端化后，構建到PUC1

4、9載體上，轉化、篩選出陽性克隆。 收集培養(yǎng)細胞，制備細胞核。將細胞核以DNA酶和高鹽適當處理，抽提出核基質。 用PCR和酶切的方法鑒定陽性重組子；體外結合實驗與瓊脂糖凝膠電泳相結合的方法鑒定分離獲得的MARs同核基質的結合活性。@2(5)測序：將能夠與核基質體外結合的MARs進行測序。 利用MAR-Wiz(http：//www.futuresoft.org/modules/MarFinder/index.html

5、，MAR-Wiz1.0)基序分析軟件對MARs的特征基序進行分析。 利用日本生物信息學研究所提供的轉錄因子結合位點分析數(shù)據(jù)庫(transcriptionfactorbindingsiteprofiledatabase，http：//www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html，version1.3)的TFSEARCH軟件進行相關生物信息學分析，預測MARs序列中具有的轉錄因子結合位點。 在人

6、基因組序列庫中，對MARs片段進行序列同源性比對，其同源性檢索來自美國國家生物信息中心(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，并對MARs序列進行染色體定位。 結果與結論：利用MARs在真核基因組中能特異性結合核基質，且結合復合物能拮抗DNaseI和高鹽處理的特性，從人T細胞株CD3+-Jurkat細胞基因組中分離、抽提出了大量的隨機MARs。并成功構建了第一個包含有238個克隆的人源隨機MAR

7、s庫，克隆片段大小為100bp～3kb不等。 本實驗成功分離、測定了12個人源的MARs序列，在S/MARtDB庫中還沒有相同序列的報道。體外結合實驗結果證明了分離的MARs具有在體外與核基質蛋白結合的生物活性。其中12個同核基質具有較強親和力的MARs測序結果表明：獲得的MARs序列長度為100bp～3kb之間、AT含量為52～66％之間，均符合MARs的堿基序列組成規(guī)律；并且MARs的AT含量與其同核基質的親和力強弱不一致。

8、 MARs序列的同源性比對結果表明，獲得的12個MARs大部分在人基因組序列中有同源序列，同源性達到99％以上的序列共有9個，分別定位在1q22、7p12、20q13、1p22、19q12、1p22、20q11、4p14、18p11。 利用生物信息學分析手段預測了人MARs在真核基因表達調控中具有的功能基序，結果顯示：同一MAR序列中不僅含有AC-和ATAT基序，還包含有多個轉錄/復制起點、增強子序列、彎曲DNA和扭結D