人基因組隨機(jī)MARs的分離、克隆及其功能的初步研究.pdf

1、背景與目的:隨著人類基因組序列草圖的完成，基因組學(xué)研究的廣泛開(kāi)展，基因表達(dá)調(diào)控研究已經(jīng)逐漸從單個(gè)基因點(diǎn)、線式的調(diào)控拓展到立體層面上多基因、基因簇以至整個(gè)基因組的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在遺傳調(diào)控過(guò)程中，反式作用因子與順式作用元件間的相互作用是構(gòu)成基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)。核基質(zhì)附著區(qū)(Matrixattachmentregions，MARs)是真核生物染色質(zhì)中可以與核基質(zhì)(Nuclearmatrix，NM)蛋白結(jié)合的一段DNA序列。它能使染色質(zhì)形成環(huán)狀

2、結(jié)構(gòu)，并與真核基因組中其它調(diào)控元件以及反式作用因子一起調(diào)節(jié)DNA復(fù)制、RNA合成和hnRNA加工等過(guò)程，在基因表達(dá)調(diào)控中起重要作用。此外，在基因工程研究中，引入MAR能消除外源基因?qū)φ衔稽c(diǎn)的敏感性，從而消除插入位點(diǎn)周圍調(diào)控元件的影響，提高轉(zhuǎn)染細(xì)胞外源基因表達(dá)的效率和穩(wěn)定性，為克服轉(zhuǎn)基因沉默或基因治療提供新的途徑。目前S/MARtDB庫(kù)中，人源的MARs僅有117個(gè)，其功能尚未全知，而人類基因組中大量的MARs有待深入研究。因此，本研究

3、擬從人基因組中分離隨機(jī)的MARs元件，構(gòu)建成隨機(jī)MARs庫(kù)；利用體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)篩選出具有MARs特性的序列，并進(jìn)行測(cè)序和相關(guān)生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)人MARs可能具有的功能結(jié)構(gòu)。為進(jìn)一步探討MARs在人基因組中的功能意義，深入認(rèn)識(shí)真核生物基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供新的理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法:利用MARs與核基質(zhì)結(jié)合后拮抗高鹽和DNA酶作用的特性，從人T細(xì)胞株CD3+-Jurkat細(xì)胞中分離MARs。 將MARs平端化后，構(gòu)建到PUC1

4、9載體上，轉(zhuǎn)化、篩選出陽(yáng)性克隆。 收集培養(yǎng)細(xì)胞，制備細(xì)胞核。將細(xì)胞核以DNA酶和高鹽適當(dāng)處理，抽提出核基質(zhì)。 用PCR和酶切的方法鑒定陽(yáng)性重組子；體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)與瓊脂糖凝膠電泳相結(jié)合的方法鑒定分離獲得的MARs同核基質(zhì)的結(jié)合活性。@2(5)測(cè)序：將能夠與核基質(zhì)體外結(jié)合的MARs進(jìn)行測(cè)序。 利用MAR-Wiz(http：//www.futuresoft.org/modules/MarFinder/index.html

5、，MAR-Wiz1.0)基序分析軟件對(duì)MARs的特征基序進(jìn)行分析。 利用日本生物信息學(xué)研究所提供的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析數(shù)據(jù)庫(kù)(transcriptionfactorbindingsiteprofiledatabase，http：//www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html，version1.3)的TFSEARCH軟件進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)MARs序列中具有的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。 在人

6、基因組序列庫(kù)中，對(duì)MARs片段進(jìn)行序列同源性比對(duì)，其同源性檢索來(lái)自美國(guó)國(guó)家生物信息中心(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，并對(duì)MARs序列進(jìn)行染色體定位。 結(jié)果與結(jié)論：利用MARs在真核基因組中能特異性結(jié)合核基質(zhì)，且結(jié)合復(fù)合物能拮抗DNaseI和高鹽處理的特性，從人T細(xì)胞株CD3+-Jurkat細(xì)胞基因組中分離、抽提出了大量的隨機(jī)MARs。并成功構(gòu)建了第一個(gè)包含有238個(gè)克隆的人源隨機(jī)MAR

7、s庫(kù)，克隆片段大小為100bp～3kb不等。 本實(shí)驗(yàn)成功分離、測(cè)定了12個(gè)人源的MARs序列，在S/MARtDB庫(kù)中還沒(méi)有相同序列的報(bào)道。體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了分離的MARs具有在體外與核基質(zhì)蛋白結(jié)合的生物活性。其中12個(gè)同核基質(zhì)具有較強(qiáng)親和力的MARs測(cè)序結(jié)果表明：獲得的MARs序列長(zhǎng)度為100bp～3kb之間、AT含量為52～66％之間，均符合MARs的堿基序列組成規(guī)律；并且MARs的AT含量與其同核基質(zhì)的親和力強(qiáng)弱不一致。

8、 MARs序列的同源性比對(duì)結(jié)果表明，獲得的12個(gè)MARs大部分在人基因組序列中有同源序列，同源性達(dá)到99％以上的序列共有9個(gè)，分別定位在1q22、7p12、20q13、1p22、19q12、1p22、20q11、4p14、18p11。 利用生物信息學(xué)分析手段預(yù)測(cè)了人MARs在真核基因表達(dá)調(diào)控中具有的功能基序，結(jié)果顯示：同一MAR序列中不僅含有AC-和ATAT基序，還包含有多個(gè)轉(zhuǎn)錄/復(fù)制起點(diǎn)、增強(qiáng)子序列、彎曲DNA和扭結(jié)D