人T-bet基因克隆及其功能的初步研究.pdf

1、人類轉(zhuǎn)錄因子T-bet(T-box expressed in T cells，T-bet)基因，作為Th1細胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子，在Th1細胞分化中誘導(dǎo)IFN-γ，分泌，上調(diào)IL-12Rβ2的表達，同時抑制IL-4的表達。此基因的開放閱讀框架包含1607bp，可編碼530個氨基酸殘基，其中有一個由189個氨基酸組成的能與T盒DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，主要在肺、脾臟及胸腺表達，其分布說明T-bet的表達具有限制性。 目的 克隆并鑒

2、定人T-bet基因；構(gòu)建原核表達載體并在體外表達T-bet，蛋白，純化蛋白作為抗原免疫小鼠，制備并初步鑒定單克隆抗體；構(gòu)建攜帶穿膜序列(Tat)和目的基因(T-bet)的表達載體，通過大腸埃希菌表達TAT-T-bet蛋白，將此重組蛋白轉(zhuǎn)染THP-1細胞，初步觀察T-bet在調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡中的作用。 方法 (1)從人外周血分離單個核細胞，抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，PCR擴增獲得人T-bet基因；將T-bet基因

3、克隆至pGEM-T載體，進行單、雙酶切鑒定及序列分析。 (2)將T-bet基因克隆到pQE30原核表達載體，在大腸桿菌M15中表達，獲得帶有His標簽的62KD左右的T-bet融合蛋白；利用Bio-Rad公司的IMAC柱純化T-bet蛋白；以T-bet蛋白作為抗原免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0細胞融合，在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)并篩選得到分泌抗T-bet單克隆抗體的雜交瘤細胞株。 (3)T-bet基因克隆

4、到pIRES<,2>-eGFP真核表達載體，將重組質(zhì)粒pT-bet通過電穿孔法導(dǎo)入人單核巨噬細胞株THP-1，并以空質(zhì)粒電轉(zhuǎn)THP-1細胞作為陰性對照；用G418篩選電轉(zhuǎn)陽性細胞，得到單個克隆陽性細胞株。 (4)將穿膜序列TAT重組到pQE30載體上，構(gòu)建具有穿膜功能的原核表達載體；再將T-bet基因重組到pQE30-TAT載體上，在大腸埃希菌M15中表達具有穿膜功能的T-bet蛋白；將純化的穿膜蛋白加入THP-1細胞培養(yǎng)體系，

5、觀察穿膜現(xiàn)象及效率；將蛋白轉(zhuǎn)染的THP-1細胞與外周血CD4<'+>T細胞共培養(yǎng)，初步觀察TAT-T-bet對THP-1細胞的作用，探討轉(zhuǎn)染的THP-1細胞對CD4<'+>T細胞分化的影響。 結(jié)果 (1)成功克隆了包括1607bp編碼區(qū)的人T-bet基因全長，并在大腸埃希菌有效表達，獲得了純化的T-bet蛋白。 (2)成功制備了人T-bet單克隆抗體，經(jīng)三個月克隆和篩選，獲得三株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株，經(jīng)EL

6、ISA和Western-blot鑒定具有良好的反應(yīng)性及特異性。 (3)構(gòu)建具有穿膜功能的pQE30原核表達載體，獲得T-bet穿膜蛋白，并以濃度和時間依賴的方式轉(zhuǎn)染THP-1細胞，轉(zhuǎn)染的THP-1細胞與CD4<'+>T細胞共培養(yǎng)，能誘導(dǎo)CD4<'+>T細胞分泌IFN-γ，促進Th1細胞的分化。 結(jié)論 獲得了人T-bet克隆并在大腸埃希菌中有效表達。制備和純化了人T-bet蛋白，并以此為抗原，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備了分