蠟樣芽孢桿菌M22超氧化物歧化酶（SOD）基因在畢赤酵母中的表達(dá).pdf_第1頁
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文檔簡介

1、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase;EC 1.15.1.1;SOD)是廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶,是機體內(nèi)唯一以超氧陰離子自由基(Oˉ<,2>)為底物的酶,它能專一地催化Oˉ<,2>的歧化反應(yīng),生成過氧化氫和氧氣,能有效的抵御氧自由基和其他氧化物自由基對細(xì)胞質(zhì)膜的毒性,對機體防御氧化損傷起著十分重要的作用.該研究成功構(gòu)建了畢赤酵母(Pichiapastoris)胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒pPICZA-sodM18,質(zhì)粒線性化后通

2、過電激法導(dǎo)入畢赤酵母GS115,Zeocin抗性梯度篩選得到高拷貝重組菌株.PCR鑒定及Mut表型分析進(jìn)一步說明,目標(biāo)基因已經(jīng)重組到宿主菌基因組染色體上;0.5﹪甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后,SDS-PAGE結(jié)果顯示,表達(dá)的蛋白相對分子量約為23kD,活性電泳出現(xiàn)明顯活性條帶;酶活性測定顯示,重組菌株SOD活性比對照提高5倍左右;氯仿-乙醇(3:5/V:V)和KCN(5mmol/L)抑制反應(yīng)進(jìn)一步證明,所表達(dá)的SOD為錳超氧化物歧化酶.結(jié)果表明來源于

3、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的Mn-sod2基因在畢赤酵母中得到正確表達(dá).成功構(gòu)建了畢赤酵母(Pichiapastoris)分泌表達(dá)質(zhì)粒pPICZoA-sodM18、pPICZαA-sodC,質(zhì)粒線性化后通過電激法導(dǎo)入畢赤酵母GS115,Zeocin抗性梯度篩選得到高拷貝重組菌株.PCR鑒定進(jìn)一步說明,目標(biāo)基因已經(jīng)重組到宿主基因組染色體上;0.5﹪甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后,活性電泳出現(xiàn)明顯活性條帶,重組酵母發(fā)酵液中Mn-SOD的

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