幽門螺桿菌超氧化物歧化酶基因克隆、表達(dá)及多克隆抗體制備.pdf

1、近幾年的研究揭示,細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白(Cytotoxin-associated geneA,CagA)是幽門螺桿菌(H.pylori)重要的毒力因子之一。進(jìn)一步研究CagA蛋白的生物學(xué)功能及其參與H.pylori致病的機(jī)制,鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院幽門螺桿菌研究組利用同源重組技術(shù),構(gòu)建了cagA基因敲除突變株(Hp27ΔcagA),通過比較遺傳背景相同的野生株與突變株生物學(xué)特性差異以及利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)其菌體蛋白表達(dá)差異的分析,篩選和

2、鑒定出與cagA基因相關(guān)的H.pylori功能蛋白。其中超氧化物歧化酶(SOD)為突變株與野生株菌體表達(dá)差異蛋白之一。而SOD蛋白與CagA之間的關(guān)系尚未見報(bào)道。為了進(jìn)一步研究SOD蛋白與CagA之間的關(guān)系,首先我們需要制備出SOD蛋白的多克隆抗體,以便進(jìn)一步確證SOD蛋白在野生株和敲除株之間有差異。
　　方法:(1)自行設(shè)計(jì)引物,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因片段。(2)利用Taq聚合酶克隆的特性,將擴(kuò)增的目的基因片段連接到pMD1

3、9-T載體上,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5a)。(3)使用NdeⅠ、XhoⅠ酶雙切,將目的基因片段與pET30(a)連接,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(BL21)。(4)誘導(dǎo)表達(dá)后,利用融合蛋白帶有6個(gè)His標(biāo)簽的特性,使用Ni-NTA柱純化目的蛋白。(5)將純化出來的目的蛋白作為抗原,免疫兔子制備多克隆抗體血清。(6)ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)。
　　結(jié)果:(1)以Hp27總DNA組為模板,擴(kuò)增出了sod基因片段。(2)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后

4、,與pMD19-T載體連接、轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌,測(cè)序后表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD19-sod。(3)測(cè)序后表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET30-sod。(4)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,蛋白產(chǎn)物進(jìn)行Ni-NTA親和層析純化,分離純化到純度較高的其C-端含有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的SOD蛋白。(5)ELISA檢測(cè)血清抗體效價(jià)>1:3200,表明成功制備出多克隆血清抗體。
　　結(jié)論:(1)首次由Hp27中克隆出sod基因片段。(2)對(duì)重組質(zhì)粒pET3