草莓鑲脈病毒P6基因致病機(jī)制研究.pdf

1、病毒能夠編碼一些與致病相關(guān)的蛋白從而調(diào)控寄主植物生理代謝過程，讓寄主產(chǎn)生相關(guān)癥狀。研究證明，草莓鑲脈病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）編碼的P6蛋白是一個(gè)癥狀決定子，在病毒侵染草莓的過程中起關(guān)鍵作用，但目前尚不明確其具體分子致病機(jī)制。本課題開展了P6蛋白的相關(guān)致病功能研究，并且利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-Seq）全面了解病毒侵染草莓后各基因的表達(dá)差異，進(jìn)一步驗(yàn)證差異基因的功能，為在分子水平上闡述

2、 SVBV的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　1.瞬時(shí)浸潤SVBV P6及其突變體
　　含pGR-P6，pGR-?P6和空載體pGR106的農(nóng)桿菌分別浸潤本氏煙，pGR-P6和pGR-?P6浸潤的表型相似，新葉均有嚴(yán)重癥狀，而pGR106浸潤，只有較輕的癥狀。ELISA檢測(cè)P6和?P6是否在本氏煙中表達(dá)，結(jié)果表明，pGR-P6能表達(dá)P6蛋白，而pGR-?P6不能表達(dá)P6蛋白。為了進(jìn)一步確定?P6蛋白的表達(dá)情況，構(gòu)建重組表達(dá)載體pGR

3、-P6-GFP和pGR-?P6-GFP，瞬時(shí)浸潤本氏煙，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， pGR-P6-GFP浸潤的本氏煙葉片出現(xiàn)綠色熒光，而 pGR-?P6-GFP浸潤的本氏煙葉片無綠色熒光出現(xiàn)，說明P6能夠正常翻譯下游GFP，而?P6不能正常翻譯。結(jié)果表明，SVBV P6可能在RNA水平上影響植株的癥狀表型。
　　2. SVBV P6對(duì)PVX的復(fù)制及對(duì)GFP表達(dá)的影響
　　pGR-P6、pGR-?P6和空載體 pGR106分別浸潤本氏煙葉片，

4、Northern blot和 qRT-PCR檢測(cè)系統(tǒng)葉中 PVX RNA的積累水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種 pGR-P6、pGR-?P6和pGR106的本氏煙系統(tǒng)葉中，PVX RNA的積累水平差異不顯著，說明P6和?P6對(duì)PVX的復(fù)制水平均沒有影響。pBIN-P19、pCAM-P6、pCAM-?P6和空載體 pCAM2300分別與 pCAM-GFP共浸潤本氏煙葉片，Northern blot和Westhern blot分別檢測(cè) GFP在 RNA

5、水平和蛋白水平上的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， pCAM-P6和 pCAM-GFP共浸潤， GFP的表達(dá)量顯著提高；pCAM-?P6和pCAM-GFP共浸潤，GFP表達(dá)量與陰性對(duì)照相比差異不顯著，說明P6蛋白能夠促進(jìn)GFP的表達(dá)。
　　3. SVBV P6和突變體的細(xì)胞定位
　　pCAM-P6-GFP瞬時(shí)浸潤本氏煙葉片，融合蛋白P6-GFP的熒光主要分布在細(xì)胞核上。說明P6蛋白可以在細(xì)胞核中富集。生物信息學(xué)分析表明，P6蛋白的192-

6、223aa和402-426aa可能是核定位功能域。構(gòu)建重組表達(dá)載體pCAM-P6(?192-223aa)-GFP和 pCAM-P6(?402-426aa)-GFP，分別瞬時(shí)浸潤本氏煙葉片。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P6和P6(?192-223aa)均定位于細(xì)胞核中，而P6(?402-426aa)主要分布于細(xì)胞輪廓上，說明P6蛋白402-426 aa可能是P6的核定位信號(hào)區(qū)域。這一部分可能是P6的致病功能域。
　　4. SVBV P6蛋白與SVBV

7、編碼其他蛋白間的互作
　　雙分子熒光互補(bǔ)驗(yàn)證SVBV P6蛋白與SVBV編碼其他蛋白間互作。YFPn-P6分別與YFPc-P2和YFPc-P4共浸潤，YFPc-P6分別與YFPn-P2， YFPn-P4共浸潤。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各處理組均無黃色熒光，說明P6與P2和 P4均不能互作。進(jìn)一步驗(yàn)證P6和 P4蛋白的自身互作，YFPn-P6與YFPc-P6及YFPn-P4與YFPc-P4共浸潤，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P4本身可以互作，有顯著的熒光出現(xiàn)，P6

8、自身不能互作，無熒光。
　　酵母雙雜交驗(yàn)證SVBV P6蛋白與P4蛋白的互作。處理組AD-P6與BK-P4、BK-P6與AD-P4、AD-P6與BK-P6及AD-P4與BK-P4分別共轉(zhuǎn)化酵母，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅AD-P4與BK-P4共轉(zhuǎn)化酵母可以長(zhǎng)出白色酵母菌落，說明P6與P4不能互作，P6自身不能互作，而P4自身互作。
　　5.感染SVBV的森林草莓和健康森林草莓轉(zhuǎn)錄組的差異表達(dá)
　　利用新一代測(cè)序技術(shù)（RNA-Seq）

9、，構(gòu)建了感染 SVBV的森林草莓以及健康森林草莓的文庫，比較了感病森林草莓與健康森林草莓基因表達(dá)的差異。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共得到36850個(gè)不同的Unigene，其中517個(gè)基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因。通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，涉及?；撬岽x、植物病原互作等途徑在 SVBV侵染森林草莓中起重要作用。研究結(jié)果首次闡述了 SVBV與寄主草莓之間的基因互作關(guān)系，為研究SVBV侵染森林草莓的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。
　　6. P6與草莓宿主基因MYB12的互作