利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建草莓抗鑲脈病毒植株體系的研究.pdf

1、草莓（Fragaria×ananassa.Duch.）是薔薇科草莓屬多年生草本植物，其果實(shí)含高濃度的類黃酮化合物，具有重要的保健功能和顯著的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此倍受消費(fèi)者和種植者的喜愛。在草莓的生產(chǎn)過程中，為了保持優(yōu)良品種的經(jīng)濟(jì)性狀，其主要采用匍匐莖埋壓及分株等營養(yǎng)繁殖技術(shù)繁育種苗，這導(dǎo)致了病毒病的不斷的積累和傳播，危害也日趨嚴(yán)重。目前，利用生物技術(shù)手段獲得草莓脫毒苗或抗病毒苗是避免病毒危害的唯一的有效途徑。然而，由于草莓脫毒苗仍然不具有對病

2、毒的強(qiáng)免疫力，栽培過程中依然會(huì)發(fā)生高頻率感染的可能性，所以需要定期重新培育和更換脫毒苗，這給生產(chǎn)上帶來了極大的不便，同時(shí)也造成了成本的增加。因此，利用生物技術(shù)直接培育抗病毒的草莓苗來抵抗病毒的危害，具有較大的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。
　　CRISPR/Cas9技術(shù)是自2013年興起的一種高效簡便的基因組編輯技術(shù)，目前已在動(dòng)植物中得到廣泛應(yīng)用。它主要是基于細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)改造而成，由于其可用于對DNA進(jìn)行定點(diǎn)編輯，并且可以同時(shí)作

3、用于多個(gè)靶位點(diǎn)，同時(shí)編輯多個(gè)基因，較常規(guī)轉(zhuǎn)基因方法具有明顯優(yōu)勢，且沉默效果更加徹底，因此越來越多的研究人員對其產(chǎn)生了濃厚興趣。本研究以‘紅顏’草莓(Benihoppe)，質(zhì)粒pX330、pCAMBIA1302、pUC19為材料，通過DNA重組技術(shù)成功構(gòu)建了可以在植物上使用的CRISPR/Cas9載體，并以栽培草莓的PD基因?yàn)榘形稽c(diǎn)，對構(gòu)建的CRISPR/Cas9載體進(jìn)行了初步的驗(yàn)證，同時(shí)分別構(gòu)建了可作用于SVBV病毒ORFⅣ序列和同時(shí)作

4、用于ORFⅣ、ORFⅥ序列的‘紅顏’草莓轉(zhuǎn)基因植株體系。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.以質(zhì)粒pX330、pCAMBIA1302、pUC19為材料，采用DNA重組技術(shù)構(gòu)建CRISPR/Cas9載體。結(jié)果表明:Cas9序列通過重組已成功替換了pCAMBIA1302中mgfp序列，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，簡寫為pCC; sgRNA序列成功接入了pUC19的多克隆位點(diǎn)區(qū)，重組質(zhì)粒簡寫為pSG，pCC和pSG共同組成了CRISPR/Cas9載

5、體的兩個(gè)基本載體。
　　2.選取‘紅顏’草莓PDS基因?yàn)榘形稽c(diǎn)，構(gòu)建CRISPR/Cas9載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化‘紅顏’草莓葉片，建立起草莓CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用的遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明:作用于PD基因靶位點(diǎn)的CRISPR/Cas9載體構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)化后在愈傷組織中能夠檢測到PDS基因靶位點(diǎn)內(nèi)及鄰近區(qū)域的核苷酸突變，但未檢測到核苷酸的缺失和插入。建立的草莓CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用的遺傳轉(zhuǎn)化體系為:葉片預(yù)培養(yǎng)3天;使

6、用OD600=0.1的農(nóng)桿菌GV3101懸浮液侵染葉盤組織20分鐘;在含100μM乙酰丁香酮和50μM硫辛酸的共培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天;轉(zhuǎn)入含100μM井岡霉素A、250mg/L特美汀、250mg/L頭孢噻圬的延遲培養(yǎng)基上培養(yǎng)6天;在含250mg/L特美汀、250mg/L羧芐青霉素、5mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)上進(jìn)行選擇培養(yǎng)，之后逐漸提高潮霉素的濃度至10mg/L。
　　3.選取SVBV病毒的ORFⅣ和ORFⅥ序列為靶位點(diǎn)，分別構(gòu)建作用于