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文檔簡介
1、自1980年Sohendra N首次報道成功應(yīng)用膽道塑料支架進(jìn)行膽道梗阻引流以來,膽道支架已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在各種病因引起的膽道梗阻。膽道支架能安全有效地進(jìn)行膽道減壓引流,姑息性的膽道支架植入現(xiàn)已經(jīng)取代外科姑息膽腸內(nèi)引流或者放置T管外引流手術(shù)。然而,支架梗阻,隨之而發(fā)生的黃疸再發(fā),并且常常伴有急性膽管炎是膽道支架術(shù)后的主要并發(fā)癥,發(fā)生率為10%~30%,經(jīng)常是發(fā)生急性梗阻性化膿性膽管炎,敗血癥而危及生命。膽道支架梗阻的原因包括支架的設(shè)計、支
2、架材料的性質(zhì)、支架表面的不平整形成微生物被膜和膽泥淤積。而微生物聚集形成微生物膜后導(dǎo)致的膽泥淤積、膽道感染是最常見原因和后果。至今為止,臨床尚缺乏有效抗菌膽道塑料支架能夠減少支架植入后的膽道感染、延長支架通暢期提高生存率。
目前,納米材料已成為材料科學(xué)領(lǐng)域中的熱點(diǎn),納米銀(Nano Silver)就是將粒徑做到納米級的金屬銀單質(zhì)。納米銀粒徑大多在25納米左右,對大腸桿菌、淋球菌、沙眼衣原體等數(shù)十種致病微生物都有強(qiáng)烈的抑制和殺滅
3、作用,而且不會產(chǎn)生耐藥性。動物試驗(yàn)表明,這種納米銀抗菌微粉即使用量達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)劑量的幾千倍,受試動物也無中毒表現(xiàn)。同時,它對受損上皮細(xì)胞還具有促進(jìn)修復(fù)作用。值得一提的是,該產(chǎn)品遇水抗菌效果愈發(fā)增強(qiáng),更利于疾病的治療。
納米銀殺菌具有以下特點(diǎn):
1.廣譜抗菌。納米銀顆粒直接進(jìn)入菌體與氧代謝酶(-SH)結(jié)合,使菌體窒息而死的獨(dú)特作用機(jī)制,可殺死與其接觸的大多數(shù)細(xì)菌、真菌、霉菌、孢子等微生物。
2.強(qiáng)效殺菌。據(jù)研究發(fā)
4、現(xiàn),Ag可在數(shù)分鐘內(nèi)殺死650多種細(xì)菌。納米銀顆粒與病原菌的細(xì)胞壁/膜結(jié)合后,能直接進(jìn)入菌體、迅速與氧代謝酶的巰基(-SH)結(jié)合,使酶失活,阻斷呼吸代謝使其窒息而死。獨(dú)特的殺菌機(jī)理,使得納米銀顆粒在低濃度就可迅速殺死致病菌。
3.滲透性強(qiáng)。納米銀顆粒具有超強(qiáng)的滲透性,可迅速滲入皮下2mm殺菌,對普通細(xì)菌、頑固細(xì)菌、耐藥細(xì)菌以及真菌引起的較深處的組織感染均有良好的殺菌作用。
4.修復(fù)再生。納米銀可促進(jìn)傷口愈合,促進(jìn)受損
5、細(xì)胞的修復(fù)與再生,去腐生肌,抗菌消炎改善創(chuàng)傷周圍組織的微循環(huán),有效地激活并促進(jìn)組織細(xì)胞的生長,加速傷口的愈合,減少疤痕的生成。
5.安全無毒。早在《本草綱目》中記載:生銀,無毒;美國公共衛(wèi)生局1990年《關(guān)于銀毒性的調(diào)查報告》中說明:銀對人體無明顯毒副作用;納米銀是局部用藥,銀含量少,是最安全的用藥方式
6.無耐藥性。納米銀屬于非抗菌素殺菌劑:納米銀能殺滅各種致病微生物,比抗菌素更強(qiáng),10nm大小的納米銀顆粒獨(dú)特抗菌
6、機(jī)理可迅速直接殺死細(xì)菌,使其喪失繁殖能力,因此,無法生產(chǎn)耐藥性的下一代,能有效避免因耐藥性而導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作久治不愈。
目的:
研發(fā)新型的納米銀涂層膽道塑料支架并研究此新型支架在體內(nèi)、外抗菌效果和延長支架通暢期情況。
方法:
本研究以抗凝血性肝素作為聚陰離子,以具有抗菌作用的殼聚糖作為聚陽離子復(fù)合具有長效廣譜抗菌性能的納米銀,采用旋涂層層組裝方法構(gòu)建成納米銀涂層的膽道塑料支架。通過多層膜的表面形貌用A
7、FM和SEM觀察,材料表面分析及紫外分光光度計表征。體外納米銀釋放檢測和抗菌實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn):64只中國巴拿實(shí)驗(yàn)豬,雌雄不限,體重為30kg-40kg,隨機(jī)分為A組(對照組,control)32只:植入臨床用的COOK公司特氟龍膽道塑料支架(臨床常用);B組(實(shí)驗(yàn)組,AgNP)32只:植入納米銀涂層的膽道塑料支架。每組各8只用作觀察支架通暢期和豬生存期。每組另24只按照在術(shù)后第4、12、24、48周經(jīng)豬耳緣靜脈抽血作血常規(guī)、生化、細(xì)胞因子
8、檢測分析豬的生存狀態(tài)。上述每一節(jié)點(diǎn)6只豬再手術(shù)抽門靜脈血、膽總管抽膽汁作細(xì)菌培養(yǎng),取出膽道支架,切取膽管吻合口組織作檢測。豬均單籠飼養(yǎng)在浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,專人飼養(yǎng),觀察豬一般情況,如果豬出現(xiàn)胃納差,發(fā)熱,皮膚黃染等癥狀,立即終止實(shí)驗(yàn)觀察,再手術(shù)取標(biāo)本檢測。再手術(shù)從原切口進(jìn)腹,觀察腹腔粘連情況及膽管吻合口情況。剪開吻合口觀察大體標(biāo)本后,取膽管吻臺口及上下1cm左右膽管組織分為4份,一份浸泡于10%福爾馬林中固定,進(jìn)行HE染色、Mass
9、on染色;一份用2.5%戊二醛固定行電鏡檢查;其余二份保存在-80℃冰箱內(nèi)備用。取肝臟組織一塊行HE染色.實(shí)驗(yàn)豬采用肌松劑法處死。整個動物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心倫理要求。
統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS19.0 for Windows軟件進(jìn)行。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用Students' T-Test檢驗(yàn),獨(dú)立樣本采用Mann.Whimey U檢驗(yàn),配對樣本采用Wilcoxon符號秩檢驗(yàn)。P值小于0.05為兩組間有
10、顯著性差異,P值小于0.01時兩組間有非常顯著性差異。豬生存率采用Kaplan-Meier生存曲線分析。
結(jié)果:
紫外檢測用來表征納米銀的合成結(jié)果,肝素和殼聚糖呈近乎嚴(yán)格層層交替排列,這可能是由于基材表面最外層能被完全涂覆,而僅受到次外層的少量穿插。其中奇數(shù)層的接觸角比偶數(shù)層的接觸角要小,由于肝素的親水性要比殼聚糖的親水性要好,說明奇數(shù)層肝素含量相對較多,偶數(shù)層殼聚糖含量相對較多。紫外分光光度儀檢測用來跟蹤載納米銀的
11、殼聚糖與肝素組裝過程。由于納米銀在433nm處的紫外吸收,多層膜在該處有最大吸收??吹?,最大吸收值均隨組裝雙層膜數(shù)增加而增加并呈線性變化,說明殼聚糖納米銀是逐層組裝的。隨著組裝雙層膜數(shù)的增加,多層膜的載銀量相應(yīng)增加,因此納米銀的吸收值增加。用AFM的敲打模式觀察了分別采用旋涂法和浸涂法組裝的多層膜表面形貌,結(jié)果顯示組裝方法對表面粗糙度有很大的影響,采用浸涂法組裝時的表面較粗糙(RMS=22.37nm),而通過旋涂法組裝的多層膜則表面較平
12、坦(RMS=14.73nm)。同時旋涂使組裝時間縮短了近5個小時,這對于工藝化的實(shí)現(xiàn)大大節(jié)約了時間,提高了效率。
體外抗菌測試:殼聚糖納米銀/肝素多層膜(PET-1)則體現(xiàn)出了很強(qiáng)的抗菌性能,相同組成的多層膜在PBS緩沖溶液中放置1個月后(PET-2)的抗菌結(jié)果顯示了多層膜的長效抗菌性。多層膜在PBS中放置了近一個月,仍體現(xiàn)出較好的抗菌性能。
手術(shù)情況:所有手術(shù)均順利完成,術(shù)中麻醉平穩(wěn),無術(shù)中死亡發(fā)生,術(shù)后恢復(fù)順利,
13、無圍手術(shù)期死亡。無術(shù)后腸梗阻及明顯膽瘺發(fā)生。術(shù)后第4周,對照組和實(shí)驗(yàn)組豬生活狀況良好,胃納可,無發(fā)熱和黃染。超聲掃描肝內(nèi)外膽管無擴(kuò)張,支架在膽道內(nèi),位置良好。對比對照組(40.13±3.30 weeks),實(shí)驗(yàn)組(72.37±4.23 weeks)支架通暢期明顯延長(p<0.0001)。
實(shí)驗(yàn)組和對照組生存率比較結(jié)果:在用于觀察生存率的各8只豬中,實(shí)驗(yàn)組8只豬平均生存時間是73.88±4.06周,而對照組8只豬平均生存時間是4
14、1.38±3.24周。Kaplan-Meier生存曲線顯示實(shí)驗(yàn)組生存率明顯延長。實(shí)驗(yàn)組和對照組膽道細(xì)菌感染情況:在每一節(jié)點(diǎn)4、12、48周,每批6只豬抽的膽汁細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果顯示,對照組細(xì)菌培養(yǎng)陽性率逐步升高,分別為0%,33.33%,50%和100%。而實(shí)驗(yàn)組從4周至48周,膽汁細(xì)菌培養(yǎng)均為陰性。在抽到的膽汁培養(yǎng)陽性細(xì)菌中,主要是大腸埃希氏菌,金黃色葡萄球菌,鵪鶉雞腸球菌D,陰溝腸桿菌,肺炎克雷白氏桿菌,糞腸球菌。其中,又以大腸埃希氏菌最
15、多見,占6/11(54.55%)。證實(shí)了納米銀涂層的膽道塑料支架良好的抗菌性。膽管吻合口組織H&E染色、Masson'strichrome染色在術(shù)后48周膽管吻合口組織切片結(jié)果顯示,對照組吻合口疤痕增生明顯,膠原纖維組織增多,肌纖維組織減少,炎癥細(xì)胞浸潤明顯。術(shù)后肝功能變化:因?yàn)槟懙乐Ъ芄W钑?dǎo)致血液總膽紅素升高,以直接膽紅素為主。同時膽道梗阻,伴隨著Y-GT升高。對照組和實(shí)驗(yàn)組豬每4、12、24、48周均經(jīng)耳緣靜脈抽血生化檢查,結(jié)果顯
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