新型有序納米介生物活性玻璃作為骨組織工程支架材料的基礎性研究.pdf

1、目的：
　　 新型有序納米介孔生物玻璃80S(Mesoporous Bioactive Glasses80S，MBG80S，以下簡稱MBG)是復旦大學嚴曉霞等通過采用溶劑揮發(fā)誘導自組裝并結合溶膠-凝膠技術制備的一類新型材料。初步研究表明，其具有良好的體外生物活性和生物相容性。本文研究新型有序納米介孔生物活性玻璃在體外模擬實驗中的力學性能變化及其機制，對骨形成蛋白-2(BMP-2)的吸附和緩釋效應及其機制和對成骨細胞增殖，分化，礦

2、化以及粘附的作用，以探討其進一步發(fā)展為骨組織工程支架材料的可能性。
　　 方法：
　　 第一部分實驗中，將MBG80S粉劑壓制成型后，浸泡于SBF液中，10天中于各時間點取出后取一枚掃描電鏡觀察表面和內部的變化，其余測試彈性模量和壓縮強度，并測定濾液中的離子濃度和PH變化。并以具有相同化學組分無介孔結構的生物玻璃80S(BG80S，以下簡稱BG)為對照組平行測試。
　　 第二部分實驗中，我們利用與rhBMP-2有

3、近似結構、等電點和分子量的a-糜蛋白酶(a-Chy)為模擬蛋白，用I125同位素標記作為示蹤，研究了MBG單體粉劑的吸附曲線，MBG成型片劑的吸附曲線和MBG80S片劑兩周的短期釋放曲線。同樣以BG為對照，分析其吸附和釋放機制。最后我們用I125同位素標記rhBMP-2，描記MBG成型片劑三個月的釋放曲線，總結藥代動力學規(guī)律。
　　 第三部分實驗中，用混合酶消化法分離大鼠顱蓋骨成骨細胞，進行原代培養(yǎng)；成骨細胞與不同濃度的MBG浸

4、提液作用后，以空白培養(yǎng)液為對照，MTT法測定細胞增殖；PNPP法檢測堿性磷酸酶活性；礦化結節(jié)計數(shù)和面積測量分析MBG對成骨細胞礦化能力的影響。并測定MBG浸提液和空白培養(yǎng)液中的離子濃度。同時用0.0625％濃度的MBG浸提液配制不同濃度的rhBMP-2-MBG培養(yǎng)液，以空白培養(yǎng)液和不同濃度的rhBMP-2培養(yǎng)液為對照，MTT法測定細胞增殖；PNPP法檢測堿性磷酸酶活性。
　　 第四部分實驗中用混合酶消化法分離大鼠顱蓋骨成骨細胞，

5、進行原代培養(yǎng)；將細胞接種于MBG片劑上，培養(yǎng)3d，7d，11d，掃描電鏡觀察成骨細胞形態(tài)學和粘附情況。
　　 結果：
　　 1.電鏡下MBG材料表面和內部在4小時以后就有含碳羥基磷灰石(HCA)的生長，材料顆粒間縫隙的數(shù)量和尺寸都明顯減小，顆粒間相互融合。而BG80S材料表面和內部無明顯晶體生長。力學測試表明初始強度相同的MBG80S和BG80S材料，在SBF液中浸泡4小時后力學性能發(fā)生了完全不同的變化，前者的彈性模量快

6、速上升100-150MPa，48小時后維持于250-200MPa，壓縮強度基本同步，在20-30MPa和30-40MPa之間。而BG快速下降，彈性模量和壓縮強度分別維持在20MPa左右和10MPa以下。離子濃度和PH變化，MBG和BG材料之間，MBG材料與粉劑之間也有明顯的不同。提示MBG的快速表面晶體生長是改變材料力學性能的主要原因，同時也改變了材料內外的物質交流。
　　 2.MBG和BG粉劑本身蛋白快速吸附在4小時時達到最大

7、，分別為47.080ug/mg和19.912ug/mg(蛋白/材料)，此后隨著MBG表面HCA晶體生長，其蛋白吸附仍有進一步增長，而BG則沒有明顯變化。壓片后，MBG和BG材料的最大吸附量和吸附曲線形態(tài)較粉劑都有較大的變化，由于HCA晶體生長改變了材料內外的物質交流，MBG改變更大。在模擬蛋白a-Chy的短期釋放實驗中，MBG和BG都有緩釋作用，但MBG緩釋更為平緩。
　　 在對rhBMP-2的釋放實驗中，MBG表現(xiàn)出良好的緩釋

8、性能，其釋放行為符合Hugichi方程，MBG對rhBMP-2的50％緩釋時間為248.38天。
　　 3.0.5％以下各濃度組MBG浸提液均對成骨細胞增殖無影響，而1％濃度組對細胞增殖有輕度抑制，與對照組相比差異有統(tǒng)計學顯著意義；各濃度MBG浸提液均可以增強堿性磷酸酶活性，與對照組相比，其中0.0625、0.125、0.25％濃度明顯提高ALP活性，差異有明顯的統(tǒng)計學意義；0.0625％濃度時，礦化結節(jié)數(shù)目無明顯變化，而礦化結

9、節(jié)面積則明顯增加。提示MBG在低濃度時對成骨細胞由較好的促進分化和礦化作用，對增殖無明顯作用。
　　 用0.0625％濃度的MBG浸提液配制不同濃度的rhBMP-2-MBG培養(yǎng)液培養(yǎng)成骨細胞后，與空白培養(yǎng)液相比各濃度組rhBMP-2-MBG培養(yǎng)液對細胞增殖和分化無明顯作用，但相同蛋白濃度的rhBMP-2-MBG培養(yǎng)液和rhBMP-2-細胞培養(yǎng)液相比有明顯差異，提示rhBMP-2與MBG浸提液中的產物可能在分子生物學水平上有某種相

10、互影響的作用。
　　 4.掃描電鏡下細胞形態(tài)分化良好，胞體伸長呈長梭形、多邊形或異型形，細胞表面具有較多的皺褶和微絨毛，眾多絲狀和纖維狀突起伸展相互聯(lián)接形成網(wǎng)狀。成骨細胞在材料表面粘附良好，細胞相互之間結合良好。提示MBG對成骨細胞有良好的生物相容性和粘附性能。
　　 結論：
　　 新型有序納米介孔生物玻璃80S(MBG80S)在體外試驗中，具有良好的力學性能，對中低分子有良好的吸附和緩釋作用，對成骨細胞有良好的