新型組織工程角膜支架材料的實驗研究.pdf

1、正常角膜構(gòu)成眼球的第一道屏障，完成70％以上的屈光功能，對視覺的形成極其重要。角膜病患病率高，致盲性強，僅次于白內(nèi)障居世界致盲原因的第二位。據(jù)WHO統(tǒng)計，每年約1000萬世界人口因角膜病而致盲。同種異體角膜移植是治療角膜盲患者最有效的方法，但角膜供體來源匱乏使其應用受到限制，角膜供體老齡化及激光手術(shù)的開展則使這種情況進一步加劇。積極尋找新的角膜供體代替同種異體角膜是眼科界亟待解決的問題。 應用組織工程技術(shù)構(gòu)建角膜旨在為角膜病的治

2、療提供較好的材料來源，是目前全球眼科界研究的熱點。而選擇合適的支架材料則是構(gòu)建組織工程角膜的瓶頸。本研究應用不同的理化方法脫細胞處理異種(豬)角膜，選擇脫細胞效果徹底且能完整保留組織結(jié)構(gòu)的標本行組織學(光鏡/電鏡/免疫組化)、生物化學、生物力學等檢測以篩選制備異種脫細胞角膜基質(zhì)的最佳方案，繼之通過生物相容性及生物安全性的檢測驗證其作為組織工程角膜載體材料的可行性，初步行細胞接種為組織工程角膜的三維構(gòu)建提供可靠的實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

3、 第一部分:異種脫細胞角膜基質(zhì)的制備 目的： 比較不同理化方法對異種角膜的脫細胞效果；篩選制備異種脫細胞角膜基質(zhì)的最佳方法并檢測其生物學性能，為組織工程化人工角膜的構(gòu)建提供理想的載體材料。 方法： 1.應用不同的去污劑及反復凍融法對豬角膜進行脫細胞處理：(1)0.25％、0.5％、1％、2％、5％Triton X-100各自分別處理12h、24h、36h、48h、72h、96h；(2)0.1％、0.25

4、％、0.5％、1％SDS；(3)0.25％、0.5％、1％SDS；(4)0.5％、1％CHAPS；(2)(3)(4)組各濃度分別處理12h、24h、36h、48h；(5)反復凍融：-80℃分別冷凍2h、24h、24h×3，室溫融化1h。通過大體形態(tài)、組織學檢查初步評價各種方法的脫細胞效果。選擇脫細胞效果徹底、組織學結(jié)構(gòu)完整的標本進行生物力學性能檢測，并以新鮮豬角膜作對照，篩選出生物力學性能良好的方法。 2.應用1篩選的方案脫細胞

5、處理豬角膜，行組織學檢禽HE染色、特殊染色(VG染色、阿利新蘭染色)、免疫組化染色(FN、LN、Ⅰ型及Ⅳ型膠原、a-SMA、a-gal)進一步檢測脫細胞的效果及角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分保留的程度，行掃描電鏡、透射電鏡檢查脫細胞角膜的超微結(jié)構(gòu)，并應用生物化學的方法檢測脫細胞前、后角膜組織的含水量、羥脯氨酸含量、可溶性蛋白及DNA成分的變化。 結(jié)論： 0.5％及1％SDS處理24h均可完全脫除豬角膜的異種細胞成分并保留完整的組織結(jié)構(gòu)

6、，其他處理方法、濃度及時間均無此效果；0.5％SDS處理24h能完全去除豬角膜的異種細胞及其抗原成分，同時保留完整的細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)、有效的生化成分及良好的機械力學性能，因而是制備異種脫細胞角膜基質(zhì)的最佳方法。 第二部分:異種脫細胞角膜基質(zhì)生物相容性及生物安全性的研究 目的： 評價異種脫細胞角膜基質(zhì)的生物相容性及生物安全性，為組織工程角膜支架材料臨床應用的安全性提供可靠的實驗依據(jù)。 方法： 1.按照

7、醫(yī)療器械生物學評價ISO10993和GB/T16886的標準和要求進行體外細胞毒性試驗、急性全身毒性試驗、熱源試驗和體內(nèi)植入試驗。(1)以普通細胞培養(yǎng)液為陰性對照，DMSO為陽性對照，應用CCK-8試劑盒檢測異種脫細胞角膜基質(zhì)浸提液對兔角膜基質(zhì)細胞的生物學影響； (2)觀察異種脫細胞角膜基質(zhì)浸提液注入鼠尾靜脈24h、48h、72h后受試動物的體重變化及生命體征變化； (3)測量異種脫細胞角膜基質(zhì)浸提液注入兔耳緣靜脈后的體溫變化； (4)

8、異種角膜基質(zhì)制備成直徑5mm、厚150μm的圓片狀，0.5％SDS處理24h并組織學檢查驗證脫細胞效果后植入兔角膜板層囊袋內(nèi)。陽性對照組植入新鮮(未脫細胞)角膜基質(zhì)，空白對照組只制作囊袋。術(shù)后每天裂隙燈觀察并于術(shù)后2w、4w、8w、12w及24w取角膜行組織病理學檢查。 2.以PK15細胞為陽性對照，應用RT-PCR檢測新鮮豬角膜、脫細胞豬角膜及兔角膜板層囊袋植入脫細胞豬角膜基質(zhì)4w、12w及24w的兔外周血中有無PERV基因的

9、表達。 結(jié)論： 異種脫細胞角膜基質(zhì)無細胞毒性、無急性全身毒性、無熱源性、植入體內(nèi)無毒性反應并能促進周圍角膜基質(zhì)細胞的長入，屬于無毒級生物材料并具有良好的生物相容性；0.5％SDS處理24h可以去除異種角膜基質(zhì)PERV的表達而具有一定的生物安全性；異種脫細胞角膜基質(zhì)是組織工程角膜構(gòu)建的理想載體材料。 第三部分:異種脫細胞角膜基質(zhì)為載體構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)層的實驗研究 目的： 探討以異種脫細胞角膜基質(zhì)為載

10、體構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)層的可行性，觀察脫細胞角膜基質(zhì)的體外再細胞化情況。 方法：采用組織塊培養(yǎng)的方法原代培養(yǎng)兔角膜上皮、基質(zhì)及內(nèi)皮細胞，觀察細胞生長狀態(tài)并行免疫組化檢查鑒定細胞表型。分別采用細胞懸液及基質(zhì)注射的方式在脫細胞角膜基質(zhì)表面及內(nèi)部接種基質(zhì)細胞，觀察細胞的生長情況并行組織學檢查。 結(jié)論： 組織塊原代培養(yǎng)的方法可以獲取保持正常細胞表型的3種角膜細胞；角膜基質(zhì)細胞與脫細胞豬角膜基質(zhì)共培養(yǎng)能保持正常的細胞活性與