豬的轉(zhuǎn)腺苷一磷酸脫氨酶1基因細(xì)胞系的制備.pdf

1、腺苷一磷酸脫氨酶(AMPD)是嘌呤代謝過(guò)程中一種關(guān)鍵的酶。只在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一種酶,由多基因家族編碼。該基因的活化可保護(hù)肌細(xì)胞免受能量缺乏,其功能缺失會(huì)導(dǎo)致一種代謝性肌肉疾病。本研究通過(guò)對(duì)豬AMPD1基因改變其表達(dá)和功能,達(dá)到改進(jìn)豬肌肉質(zhì)量和風(fēng)味的可能目的。本實(shí)驗(yàn)以Genbank里豬的AMPD1基因序列為基礎(chǔ),采用PCR方法克隆了民豬AMPD1基因的cDNA序列;采用雙酶切與過(guò)夜連接的方法將AMPD1基因的完整編碼區(qū)片斷連入pcDNA

2、3.1(+)真核表達(dá)載體;采用常規(guī)方法對(duì)豬的胎兒成纖維細(xì)胞和PK15細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),設(shè)計(jì)了4組不同的轉(zhuǎn)染體系,即質(zhì)粒:脂質(zhì)體=1:2/1:3/2:5/2:7,轉(zhuǎn)染結(jié)束后對(duì)其轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行比對(duì)分析;采用脂質(zhì)體法將構(gòu)建好的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入成纖維細(xì)胞和PK15細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后選擇在6天致死細(xì)胞的G418濃度作為轉(zhuǎn)染細(xì)胞所用最適的藥物篩選濃度,14天致死細(xì)胞的G418濃度作為篩選后的維持濃度,最后用PCR法鑒定所得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株。本實(shí)驗(yàn)主要研究結(jié)果如下:

3、
　　 1)成功克隆了民豬AMPD1基因的完整編碼區(qū)2207個(gè)bp序列。
　　 2)經(jīng)雙酶切鑒定后成功構(gòu)建了豬的AMPD1基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1-AMPD1。
　　 3)針對(duì)pcDNA3.1-AMPD1質(zhì)粒成纖維細(xì)胞中的最佳轉(zhuǎn)染條件為200μg/mlG418篩選濃度,100μg/ml維持濃度;在PK15細(xì)胞中的最佳轉(zhuǎn)染條件為1000μg/mlG418篩選濃度,500μg/ml維持濃度。在兩種細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒: