豬窖蛋白-1基因在小鼠成肌細(xì)胞系中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制.pdf

1、小窩蛋白(caveolin)是分子量為21-24kDa的膜整合蛋白，是胞膜窖的包被結(jié)構(gòu)成分。小窩蛋白家族含有三個(gè)成員，分別是caveolin-1、caveolin—2及caveolin—3。ceveolin-1在膽固醇平衡方面有重要作用，但是，其自身的轉(zhuǎn)錄調(diào)控并沒(méi)有深入闡明，尤其在豬的研究中，較少報(bào)道，這成為進(jìn)一步揭示其功能和利用其進(jìn)行相關(guān)方面的應(yīng)用的制約因素。有鑒于此，我們希望通過(guò)本論文的內(nèi)容，推進(jìn)豬caveolin-1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

2、研究。 首先采用PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)從豬基因組DNA中克隆到caveolin-1基因5’側(cè)翼轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，并設(shè)計(jì)多條引物，得到不同長(zhǎng)度的DNA片段-1756～—260，將它們分別克隆到pGL3-Basic載體中。轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞系之后，得到活性最高的是pGLB—260。再根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，針對(duì)caveolin-1基因5’側(cè)翼區(qū)特定區(qū)段進(jìn)行嵌套缺失和定點(diǎn)突變，獲得了系列缺失子和突變

3、子。然后應(yīng)用DLR系統(tǒng)研究鑒定了小鼠成肌細(xì)胞系C2C12中調(diào)控caveolin-1基因基礎(chǔ)表達(dá)的順式作用元件及其轉(zhuǎn)錄因子。 通過(guò)生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)在—210～—200有一個(gè)潛在HOXA1位點(diǎn)，-193～-184和-124～-114分別由一個(gè)潛在的Sp1位點(diǎn)(編號(hào)分別為Sp1.2和Sp1.3)，-141～-134有一個(gè)潛在的AP1位點(diǎn)。 用pGLB—213和pGLB-149做模板，將這些潛在的位點(diǎn)單點(diǎn)突變或雙位點(diǎn)突變

4、，以便檢測(cè)關(guān)鍵的順式元件。試驗(yàn)結(jié)果顯示，用pGLB—213作為模板，突變HOXA1或Sp1.2位點(diǎn)后，其活性分別降低50％左右；突變AP1位點(diǎn)后，活性降低30％左右；突變Sp1.3后，活性降低90％左右，基本與pGL3-Basic水平相當(dāng)。用pGLB-149作為模板，突變Sp1.3后，其活性降低約90％，基本與pGL3-Basic水平相當(dāng)。這表明Sp1.3位點(diǎn)(-123～-113)是一個(gè)在CAV1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的一個(gè)極其重要的位點(diǎn)。

5、 針對(duì)caveolin-1基因核心啟動(dòng)子元件，設(shè)計(jì)了對(duì)應(yīng)于Sp1.3的探針(-130～-105)進(jìn)行EMSA(electrophoretic mobility shift assay)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這段寡核苷酸可與C2C12細(xì)胞核中的某種核蛋白結(jié)合，形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。加入抗Sp1抗體，結(jié)合帶位置條帶減弱，表明DNA—蛋白復(fù)合物中的蛋白是Sp1。 另外，由于生物信息學(xué)分析表明，在—70～—50和—30～—20區(qū)域內(nèi)分別含有C

6、CAATbox和TATAbox，為了驗(yàn)證這一預(yù)測(cè)，將這兩個(gè)位點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)CCAATbox突變后相對(duì)熒光素酶活性下降及其顯著，幾乎與pGLB的水平相當(dāng)。而TATAbox突變后，相對(duì)熒光素酶活性有輕微降低。 本論文是對(duì)豬caveolin-1基因在C2C12細(xì)胞系中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制的首次系統(tǒng)研究。通過(guò)本研究，找到了調(diào)控caveolin-1基因基礎(chǔ)表達(dá)的核心啟動(dòng)子元件區(qū)-130～-105區(qū)段和—70～—50區(qū)段，對(duì)caveolin-1基因