基于氧化石墨烯的熒光生物傳感新方法研究.pdf

1、生物分子的快速靈敏檢測(cè)一直以來(lái)都是生物醫(yī)學(xué)和分析化學(xué)領(lǐng)域十分關(guān)注的課題?，F(xiàn)代社會(huì)的快速發(fā)展對(duì)生物傳感技術(shù)提出了更高的要求，發(fā)展新的分析方法和技術(shù)以應(yīng)對(duì)越來(lái)越多的分析難題和社會(huì)熱點(diǎn)問(wèn)題為分析化學(xué)工作者提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。熒光生物傳感技術(shù)具有靈敏度高和響應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種生物分子的檢測(cè)，包括蛋白質(zhì)、生物小分子、核酸和酶活性等。傳統(tǒng)的熒光生物傳感技術(shù)往往需要多重?zé)晒鈽?biāo)記和一系列的放大方法來(lái)提高靈敏度，從而增加了檢測(cè)的成本和實(shí)驗(yàn)的復(fù)

2、雜性。另外，傳統(tǒng)的熒光傳感技術(shù)還存在較高背景熒光的干擾。因此進(jìn)一步改進(jìn)和發(fā)展新的熒光傳感技術(shù)，以提高生物分析的性能和降低檢測(cè)的成本有十分重要的意義。
　　 氧化石墨烯(GO)由于其獨(dú)特的DNA吸附性能和通用型熒光淬滅劑的性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于生物分子的檢測(cè)?；贕O的熒光傳感器與傳統(tǒng)熒光傳感器相比有諸多優(yōu)勢(shì)，例如改進(jìn)了檢測(cè)靈敏度、降低了檢測(cè)成本和增大了信背比等，這表明基于GO的熒光傳感器在生物分子檢測(cè)方面有很大的應(yīng)用前景。這類傳感器

3、大多依賴GO能強(qiáng)烈吸附熒光染料標(biāo)記的單鏈DNA同時(shí)淬滅其熒光，目標(biāo)物與熒光單鏈DNA結(jié)合使其構(gòu)象轉(zhuǎn)變，進(jìn)而使熒光染料與GO距離拉大，熒光恢復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)。但是這類傳感器的檢測(cè)限一般有限且需要熒光標(biāo)記，有待進(jìn)一步改進(jìn)。將DNA嵌入染料與GO相結(jié)合進(jìn)行生物分子檢測(cè)已有報(bào)道，其檢測(cè)性能顯著改善，我們推斷此類非標(biāo)熒光傳感器有望在生物分子檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。
　　 本論文針對(duì)以上問(wèn)題，在綜合文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)之上，基于GO獨(dú)特的D

4、NA吸附和熒光染料淬滅性能發(fā)展了一系列簡(jiǎn)單、快速、靈敏的熒光生物傳感新方法用于DNA酶活性、核酸和三磷酸腺苷(ATP)等生物分子的檢測(cè)，具體內(nèi)容如下:
　　 第2章中，基于發(fā)夾引物和聚合延伸，結(jié)合GO獨(dú)特的DNA吸附和通用型熒光淬滅性能發(fā)展了一種新型非標(biāo)熒光檢測(cè)方法用于DNA3’磷酸酶的檢測(cè)及其抑制劑的定量表征。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了一條3’磷酸化的DNA發(fā)夾引物，只有經(jīng)DNA3’磷酸酶的去磷酸作用后，發(fā)夾引物才能發(fā)生聚合延伸生成雙鏈DN

5、A產(chǎn)物。由于GO與雙鏈DNA的結(jié)合力較弱不能有效淬滅染色雙鏈產(chǎn)物的熒光，因此得到較強(qiáng)的熒光信號(hào)。無(wú)DNA3’磷酸酶時(shí)，發(fā)夾引物不能去磷酸化引發(fā)聚合延伸，進(jìn)而被GO吸附淬滅，得到較弱的背景信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA3’磷酸酶的靈敏檢測(cè)。該方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種DNA3’磷酸酶(T4多聚核苷酸激酶和小蝦堿性磷酸酶)活性的同時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)限分別為0.07 U/mL和0.003 U/mL。另外，該方法不僅可以對(duì)DNA3'磷酸酶的抑制劑進(jìn)行定量表征，還適

6、用于復(fù)雜生物環(huán)境中目標(biāo)物的測(cè)定。本方法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、操作方便、靈敏度高且選擇性好，有望成為DNA3’磷酸酶檢測(cè)的一種很好的選擇并能應(yīng)用于DNA損傷修復(fù)機(jī)理的研究。
　　 第3章中，基于等溫循環(huán)鏈置換聚合反應(yīng)(ICSDPR)和DNA嵌入染料的光學(xué)特性，結(jié)合GO獨(dú)特的吸附和淬滅性能發(fā)展了一種非標(biāo)放大熒光DNA檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了一條3’磷酸化的發(fā)夾探針，只有加入目標(biāo)DNA與發(fā)夾雜交引發(fā)其構(gòu)象轉(zhuǎn)變，引物才能與發(fā)夾打開的莖端雜交，然后在聚合

7、酶作用下發(fā)生ICSDPR。經(jīng)過(guò)多步的循環(huán)放大，產(chǎn)生大量的雙鏈DNA產(chǎn)物，進(jìn)而得到放大的熒光信號(hào)。無(wú)目標(biāo)DNA時(shí)，發(fā)夾探針不能發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變和ICSDPR，經(jīng)SYBR GreenⅠ(SG)染色和GO吸附后，生成較低的背景信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的放大熒光檢測(cè)。該方法首次提出在GO平臺(tái)上結(jié)合SG和ICSDPR放大檢測(cè)DNA，有較寬的線性范圍和高選擇性，檢測(cè)限為4 pM，跟基于GO的均相DNA檢測(cè)相比有明顯優(yōu)勢(shì)。該方法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、方便經(jīng)濟(jì)，有望

8、成為DNA靈敏檢測(cè)的一種常用方法。
　　 第4章中，基于ATP依賴的DNA連接反應(yīng)和GO獨(dú)特的吸附和淬滅性能，發(fā)展了一種高靈敏的ATP檢測(cè)新方法。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的三種DNA探針退火雜交形成帶有單鏈缺口的熒光雙鏈DNA，在輔助因子ATP和T4 DNA連接酶同時(shí)存在下，缺口被連接形成完整的雙鏈DNA。連接產(chǎn)物有較高的熔鏈溫度能在實(shí)驗(yàn)加熱條件下保持雙鏈結(jié)構(gòu)，不被GO有效淬滅，得到較強(qiáng)的熒光信號(hào)。無(wú)ATP時(shí)，DNA連接反應(yīng)不能發(fā)生，三鏈退火的

9、復(fù)合物在實(shí)驗(yàn)加熱條件下解鏈進(jìn)而被GO吸附，熒光淬滅，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)ATP的靈敏檢測(cè)。該方法簡(jiǎn)單快速、靈敏度高選擇性好，檢測(cè)限達(dá)0.3 nM，跟大多數(shù)無(wú)放大的均相ATP適配體傳感方法相比有明顯優(yōu)勢(shì)，跟電化學(xué)適配體方法的檢測(cè)限有可比性。該方法具有高選擇性，不僅能使ATP從其它三磷酸核苷中分離開來(lái)，還可使ATP與其同系物區(qū)分開來(lái)。
　　 第5章中，基于核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)對(duì)酶切底物的選擇性和GO對(duì)單雙鏈DNA結(jié)合力的差別發(fā)展了一種

10、非標(biāo)熒光ATP檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的5’磷酸化的發(fā)夾探針能跟互補(bǔ)DNA退火雜交形成帶單鏈缺口的雙鏈DNA產(chǎn)物。在輔助因子ATP和連接酶同時(shí)存在時(shí)，缺口被連接形成完整的長(zhǎng)莖端發(fā)夾產(chǎn)物，且靠近3’端的堿基硫代處理。這種發(fā)夾產(chǎn)物不能被ExoⅢ酶切，經(jīng)SG染色和GO混合后，得到顯著的熒光信號(hào)。無(wú)ATP時(shí)，缺口不能被連接進(jìn)而被ExoⅢ酶切，互補(bǔ)DNA被降解同時(shí)釋放發(fā)夾探針，染色后的發(fā)夾被GO吸附淬滅，生成較低的背景信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)ATP的靈敏檢

11、測(cè)。該方法設(shè)計(jì)巧妙新穎，有較高的靈敏度和選擇性，檢測(cè)限達(dá)0.2 nM。
　　 第6章中，基于限制性核酸內(nèi)切酶酶切的特異性和GO對(duì)不同的DNA結(jié)構(gòu)結(jié)合力大小的差別發(fā)展了一種新型熒光方法用于檢測(cè)核酸內(nèi)切酶的活性及其抑制劑。我們?cè)O(shè)計(jì)了一條單標(biāo)記熒光發(fā)夾探針，發(fā)夾的莖端序列包含有內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。當(dāng)目標(biāo)內(nèi)切酶存在時(shí)，發(fā)夾探針被酶切成三部分，其中帶熒光染料的DNA短片段與GO結(jié)合力較小而游離到溶液中，生成較強(qiáng)的熒光信號(hào)。無(wú)目標(biāo)內(nèi)切酶時(shí)，發(fā)