細(xì)胞色素P450的高效原核表達(dá)及應(yīng)用于持久性有機(jī)污染物的檢測.pdf

1、細(xì)胞色素P450是包含一個血紅素蛋白的超大家族，它被發(fā)現(xiàn)存在于所有的生物有機(jī)體中：從細(xì)菌、酵母、真菌、植物、動物以至于人體，這個酶引人注目的特點是能夠催化廣泛的有機(jī)化合物的反應(yīng)，能使有害物質(zhì)轉(zhuǎn)變成為可溶物從體內(nèi)排出。因此它在各種生物合成和生物降解中起著重要的作用。
　　 本論文對家蠅細(xì)胞色素P4506A1(CYP6A1)和大鼠細(xì)胞色素P4501A1 (CYP1A1)這兩個基因在大腸桿菌中克隆和表達(dá)進(jìn)行了研究，表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行了初

2、步的分離和純化，并構(gòu)建生物傳感器以分別用于持久性有機(jī)污染物艾氏劑、七氯和苯并芘的分析檢測。在此工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了CYP1A1基因在煙草表達(dá)與組織定位，以用于環(huán)境中苯并芘的生物修復(fù)研究。
　　 通過PCR擴(kuò)增得到CYP6A1及CYP1A1基因的ORF序列，并經(jīng)過一定的改造與原核表達(dá)載體pCW連接，構(gòu)建了重組載體pCW/CYP6A1和pCW/ CYP1A1，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH5α中，并用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAG

3、E分析表明，CYP基因的表達(dá)產(chǎn)物的分子量大小與預(yù)期相符，對CYP6A1及CYP1A1基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步提取純化。
　　 用表面活性劑雙十八烷基二甲基溴化銨(DSAB)和雙十六烷基磷酸(DHP)分別固定初步純化的蛋白CYP6A1和CYP1A1于熱裂解石墨電極表面，構(gòu)建相應(yīng)的生物傳感器，并分別應(yīng)用于其相應(yīng)底物艾氏劑和七氯及苯并芘的催化氧化研究和分析檢測。
　　 用植物表達(dá)載體pCANMBIA1302(含綠色熒光蛋白GFP)