高強(qiáng)度聚焦超聲波殺傷細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)棘球蚴的研究.pdf

1、囊性棘球蚴病是細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)后絳幼蟲(chóng)棘球蚴寄生所致的一種嚴(yán)重的人獸共患慢性寄生蟲(chóng)病，也稱(chēng)包蟲(chóng)病。棘球蚴寄生引起的包蟲(chóng)病呈世界性分布。目前包蟲(chóng)病的治療手段包括手術(shù)和藥物治療，效果均不理想。無(wú)論是傳統(tǒng)開(kāi)腹手術(shù)還是腹腔鏡內(nèi)、經(jīng)皮穿刺介入治療等微創(chuàng)治療等手術(shù)治療方式均具侵入性。術(shù)中包囊液及棘球蚴砂溢漏會(huì)引起過(guò)敏性休克甚至死亡，術(shù)后因頭節(jié)的外漏和殘留導(dǎo)致棘球蚴病繼發(fā)感染以及引起殘腔感染、積液、膽漏等多種嚴(yán)重并發(fā)癥。苯并咪唑衍生物阿苯達(dá)唑是現(xiàn)有抗棘球

2、蚴病的治療首選藥物，但因其低溶解性和在體內(nèi)廣泛的分布性，阿苯達(dá)唑治療包蟲(chóng)病存在著病人服藥治療時(shí)間長(zhǎng)、藥物的副作用較大、治療不徹底等問(wèn)題。 高強(qiáng)度聚焦超聲波（High Intensity Focused Ultrasound，HIFU）技術(shù)是利用超聲波聲束良好的穿透性、匯聚性和方向性等特點(diǎn)，將體外低能量超聲波匯聚于機(jī)體內(nèi)特定靶區(qū)，通過(guò)在焦點(diǎn)處產(chǎn)生高溫效應(yīng)，空化效應(yīng)、聲化學(xué)效應(yīng)等高能效應(yīng)破壞組織細(xì)胞。HIFU作為一種新興的無(wú)創(chuàng)性治療

3、技術(shù)，已在臨床試用于腫瘤治療。 本課題將這種非侵入性高強(qiáng)度聚焦超聲波治療技術(shù)應(yīng)用于囊性棘球蚴，觀測(cè)高強(qiáng)度聚焦超聲波對(duì)細(xì)粒棘球蚴細(xì)胞，局部結(jié)構(gòu)原頭節(jié)以至整個(gè)寄生蟲(chóng)生長(zhǎng)的影響作用及其可能機(jī)制，探索高強(qiáng)度聚焦超聲波這一新興治療技術(shù)運(yùn)用于棘球蚴病以至其它囊性病變的可能性和可行性。 研究方法： 1、從自然感染的綿羊棘球蚴獲取內(nèi)囊分離生發(fā)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，電鏡及免疫熒光試驗(yàn)鑒定生發(fā)細(xì)胞；MTT法篩選HIFU對(duì)生發(fā)細(xì)胞增殖影響

4、的最佳作用參數(shù)；以致10％急性生發(fā)細(xì)胞死亡率的HIFU劑量處理細(xì)胞后，AnnexinV/PI熒光染色、電鏡、熒光顯微鏡結(jié)合流式細(xì)胞儀觀測(cè)HIFU對(duì)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的影響；檢測(cè)HIFU作用后細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白酶活性；Western blot檢測(cè)P53、BcL-2/Bax和Fas等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。 2、分離原頭節(jié)，觀察不同劑量的HIFU照射原頭節(jié)后的即刻殺滅作用，獲得劑量-效應(yīng)關(guān)系；以不致原頭節(jié)即刻殺傷的超聲劑量作用后

5、，根據(jù)臺(tái)盼藍(lán)排斥法染色結(jié)果以及原頭節(jié)形態(tài)變化確定原頭節(jié)死亡率，了解HIFU對(duì)原頭節(jié)生長(zhǎng)的遲發(fā)性影響；將此種輻照原頭節(jié)接種小鼠進(jìn)行返種實(shí)驗(yàn)，根據(jù)棘球蚴在體內(nèi)囊濕重及包囊形態(tài)學(xué)改變，了解HIFU對(duì)原頭節(jié)的感染能力的影響；同時(shí)行酶化學(xué)染色檢測(cè)原頭節(jié)酸性磷酸酶、葡萄糖6-磷酸酶和琥珀酸脫氫酶的活性變化。 3、用采自自然感染的綿羊棘球蚴的原頭節(jié)接種小鼠腹腔，建立小鼠繼發(fā)性棘球蚴病動(dòng)物模型；配對(duì)動(dòng)物模型小鼠進(jìn)行HIFU輻照實(shí)驗(yàn)，HIFU焦點(diǎn)

6、緊貼包囊內(nèi)壁做多層面的曲線(xiàn)閉環(huán)連續(xù)掃描，層面間距4mm，直至輻照完整個(gè)包囊；小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)2月，通過(guò)比較對(duì)照組和HIFU處理組的小鼠棘球蚴包囊減重率，觀察囊壁的形態(tài)改變及TUNEL法檢測(cè)囊壁細(xì)胞凋亡等，評(píng)價(jià)HIFU殺傷棘球蚴的效果；并通過(guò)ELISA法檢測(cè)血清IgG抗體水平及細(xì)胞因子IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-10的變化，流式細(xì)胞儀淋巴檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群的變化，RT-PCR檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子mRNA表達(dá)情況等實(shí)驗(yàn)手段，了解H

7、IFU作用后小鼠免疫功能的改變。 研究結(jié)果： 1、分離的細(xì)胞電鏡下表現(xiàn)為分化較低，較符合生發(fā)細(xì)胞功能特點(diǎn)，免疫熒光試驗(yàn)鑒定細(xì)胞表面確有細(xì)粒棘球蚴抗原成分；20W×20S，40W×10s和160W×5S為致10％急性生發(fā)細(xì)胞死亡率的HIFU劑量；經(jīng)此劑量的HIFU處理后，AnnexinV/PI熒光染色、電鏡觀察、熒光顯微鏡結(jié)合流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致：HIFU對(duì)超聲照射后存活生發(fā)細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用并可誘導(dǎo)生發(fā)細(xì)胞凋亡

8、；胞內(nèi)Caspase-3蛋白酶活性增加；未見(jiàn)P53、BcL-2/B ax和Fas等凋亡相關(guān)蛋白蛋白表達(dá)。 2、HIFU對(duì)原頭節(jié)有明顯的急性殺傷作用，隨著超聲照射劑量增大，其生物學(xué)效應(yīng)越明顯，聲功率大于200W短時(shí)照射就極易致原頭節(jié)全部即刻死亡；不致原頭節(jié)即刻殺傷的最大超聲劑量為25W×20S和50W×10S。經(jīng)此劑量的HIFU作用后全部存活的原頭節(jié)，體外培養(yǎng)過(guò)程中死亡率明顯較對(duì)照組增高，而原頭節(jié)返種實(shí)驗(yàn)時(shí)在小鼠體內(nèi)形成棘球蚴的數(shù)

9、量/能力亦降低；原頭節(jié)葡萄糖6-磷酸酶和琥珀酸脫氫酶活性較對(duì)照組明顯減弱，而酸性磷酸酶反應(yīng)產(chǎn)物與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。 3、成功建立小鼠繼發(fā)性棘球蚴病動(dòng)物模型；經(jīng)HIFU以多層面貼壁曲線(xiàn)閉環(huán)掃描方式作用后，繼續(xù)飼養(yǎng)至觀察期滿(mǎn)的小鼠體內(nèi)的棘球蚴包囊明顯減重，有縮小、實(shí)變等形態(tài)改變，囊壁結(jié)構(gòu)明顯不如對(duì)照組正常、完整并觀測(cè)到細(xì)胞凋亡；動(dòng)物模型血清IgG抗體水平無(wú)明顯變化，小鼠血清及脾淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+比值升高，小鼠血清及脾細(xì)胞

10、IFN-γ，IL-2等Th1型細(xì)胞因子含量升高，IL-4，IL-10等Th2型細(xì)胞因子水平降低。 研究結(jié)論： 1、HIFU輻照不但在體外對(duì)生發(fā)細(xì)胞和原頭節(jié)這兩種棘球蚴組成成分有明顯的急性殺傷作用，而且能夠抑制輻照后的生發(fā)細(xì)胞和原頭節(jié)生長(zhǎng)； 2、HIFU輻照能夠抑制棘球蚴在小鼠動(dòng)物模型體內(nèi)的生長(zhǎng)； 3、HIFU的殺滅機(jī)制與其高能效應(yīng)直接破壞、促進(jìn)生發(fā)細(xì)胞凋亡、抑制原頭節(jié)酶的活性以及重新激發(fā)宿主對(duì)棘球蚴有效的