細粒棘球絳蟲原頭蚴在青蒿素干預下的基因轉(zhuǎn)錄譜分析.pdf

1、目的：利用基因芯片技術研究青蒿素(ART)干預影響細粒棘球絳蟲原頭蚴存活的基因調(diào)控網(wǎng)絡，推測ART抗包蟲病的分子機制。
　　方法：從屠宰場宰殺綿羊的肝包囊獲得細粒棘球絳蟲原頭蚴，體外短暫培養(yǎng)后留實驗用，選擇以10天為干預周期，200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL為ART干預濃度，確定用于后續(xù)實驗的ART濃度及作用時間，透射電子顯微鏡鏡觀察（transmission electron

2、 microscope，TEM）ART及陽性對照藥阿苯達唑（ABZ）干預原頭蚴后超微結(jié)構(gòu)的變化，提取原頭蚴總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用細粒棘球絳蟲功能基因組微陣列基因芯片檢測ART、ABZ、溶劑二甲基亞砜（DMSO）體外干預細粒棘球絳蟲原頭蚴前后的差異表達基因，聯(lián)機檢索MAS3.0（Molecular Annotation System3.0，北京博奧公司）數(shù)據(jù)庫，對差異基因進行功能注釋，并按照參與的通路和基因的功能分別進行基因分類

3、，并以實時熒光定量PCR（qRT-PCR）對基因芯片結(jié)果進行驗證。
　　結(jié)果：體外干預實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)ART體外抗原頭蚴活性優(yōu)于ABZ；TEM觀察發(fā)現(xiàn)ART主要引起原頭蚴細胞核核破裂，核仁消失，核內(nèi)物質(zhì)顏色變深，異染色質(zhì)邊聚等現(xiàn)象。ART組基因芯片結(jié)果共有106個基因表達水平發(fā)生改變，其中100個表達上調(diào)，6個表達下調(diào)；陽性對照ABZ組共有42個基因表達水平發(fā)生改變，其中7個表達上調(diào)，35個表達下調(diào)，溶劑1％DMSO組只有4個表達上調(diào)

4、；本研究中有9個共同差異表達基因，其中ART和ABZ干預組有8個共同差異表達基因。ART組差異表達基因在KEGG中具pathway注釋的有16個，其中3個基因與代謝相關，10個基因與遺傳信息過程相關其中4個基因與DNA修復過程相關。差異基因生物學功能分類結(jié)果顯示在ART組106個差異基因中，71個基因功能未知，余下35個基因主要涉及涉及細胞骨架、細胞周期、代謝、翻譯、轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導、細胞凋亡、氧化還原等8類，ABZ組45個差異基因中，2

5、7個未知基因，余下的18個基因主要涉及細胞骨架、代謝、氧化還原、細胞周期、生物合成、翻譯、轉(zhuǎn)運等7類。ABZ體外干預原頭蚴后導致的部分差異基因所注釋結(jié)果和文獻中已知的ABZ作用機制相符合。qRT-PCR驗證其中17個差異基因，驗證結(jié)果中14個基因（包括在ART組、ABZ組中具有共同差異表達的基因）與基因芯片篩選的差異基因結(jié)果一致，其中384P10_M_17、384P09_J_05、384P17_O_09基因qRT-PCR驗證結(jié)果與基因芯

6、片結(jié)果不一致。
　　結(jié)論：ART體外具有抗細粒棘球絳蟲原頭蚴作用，與劑量、時間呈依賴性關系。ART體外殺細粒棘球絳蟲原頭蚴是通過多靶位作用來實現(xiàn)的，其基因表達譜的改變涉及多個途徑，可能存在的主要機制為影響細粒棘球絳蟲的遺傳信息過程及代謝過程，其中ART對于 DNA的損傷可能是主要機制之一。qRT-PCR驗證結(jié)果表明細粒棘球絳蟲功能基因組微陣列基因芯片用于細粒棘球絳蟲原頭蚴在青蒿素干預下的基因轉(zhuǎn)錄譜結(jié)果可信。該研究有助于為闡明ART