胞外核苷酸對人內皮(祖)細胞生物學功能的影響及其機制研究.pdf

1、第一章胞外核苷酸對人內皮細胞增殖的影響及其機制研究
　　 第一節(jié)胞外核苷酸對人內皮細胞增殖、凋亡及自噬的影響
　　 目的：
　　 觀察胞外核苷酸對人臍靜脈內皮細胞增殖、凋亡及自噬的影響。
　　 方法：
　　 采用不同濃度的胞外核苷酸(ATP，ADP，UTP，UDP)持續(xù)干預人臍靜脈內皮細胞(HUVEC-Cs)，通過CCK-8細胞增殖試驗檢測其對HUVEC-Cs增殖的影響及時間效應，流式細胞術觀察不

2、同濃度的ATP/ADP對HUVEC細胞周期時相分布及細胞凋亡的影響，質粒轉染及免疫熒光技術觀察高濃度的ATP/ADP對誘導HUVEC-Cs細胞自噬的影響，免疫印記進一步檢測細胞的自噬活動。
　　 結果：
　　 與陰性對照組相比，ATP在低濃度(1，5，10μM)時對HUVWEC-Cs增殖沒有影響，ADP僅在1μM時促進細胞增殖，但ATP和ADP在高濃度(50，100μM)時均顯著抑制細胞增殖，且呈時間依賴性，而UTP、U

3、DP對HUVEC-Cs增殖沒有影響；高濃度的ATP/ADP并不誘導HUVEC-Cs凋亡，但是顯著增加S期的細胞比例，降低G2/M期的細胞比例，對G0/G1期細胞比例沒有明顯影響：細胞自噬試驗表明高濃度的ATP/ADP顯著誘導LC3-GFP融合蛋白的形成，免疫印記表明對照組與ATP/ADP干預組的HUVEC-Cs均表達高水平的LC3-1和LC3-2。
　　 結論：高濃度的ATP/ADP通過將細胞周期阻滯于S期并誘導細胞自噬性死亡而

4、抑制HUVEC-Cs增殖，但并不涉及誘導細胞凋亡。
　　 第二節(jié) ATP抑制人內皮細胞增殖的機制研究
　　 目的：
　　 闡明ATP抑制人臍靜脈內皮細胞增殖的具體機制。
　　 方法：
　　 采用RT-PCR檢測靜息狀態(tài)下人內皮細胞表達的P2Y受體亞型，RT-PCR、Western-blot檢測不同濃度的ATP對人內皮細胞表達P2Y2和P2Y11的影響；通過CCK-8細胞增殖試驗檢測非特異性P2受體

5、阻斷劑蘇拉明對ATP抑制HUVEC-Cs增殖作用的影響；shRNA質粒轉染試驗闡明介導ATP抑制HUVEC-Cs增殖作用的P2Y受體亞型；Western-blot檢測高濃度的ATP對Erk信號通路的活化情況，CCK-8細胞增殖試驗檢測ERK通路阻斷劑U0126和PD98095對ATP抑制細胞增殖效應的影響；流式細胞術檢測ATP對順鉑誘導細胞死亡效應的影響，RT-PCR及P2Y11 shRNA質粒轉染試驗闡明其可能機制。
　　 結

6、果：
　　 1、RT-PCR結果顯示靜息狀態(tài)下，HUVEC-Cs表達高水平的P2Y2和P2Y11受體，同時表達低水平的P2Y1，4，13，14受體；原代的人主動脈內皮細胞表達高水平的P2Y11受體，同時表達低水平的P2Y2，413，14受體；RT-PCR結果表明ATP呈濃度依賴性上調HUVEC-Cs P2Y2和P2Y11受體的mRNA表達；Western-blot結果表明ATP呈濃度依賴性上調HAECP2Y2和P2Y11受體的蛋

7、白表達。
　　 2、CCK-8細胞增殖試驗表明高濃度盼ATP對HUVEC-Cs增殖的抑制作用可以被非特異性P2受體阻斷劑蘇拉明(100μM)完全阻斷。
　　 3、P2Y2和P2Y11 shRNA質粒轉染HUVEC-Cs24h后，RT-PCR檢測其瞬時轉染效率，結果表明shRNA顯著下調了HUVEC-Cs P2Y2和P2Y11的mRNA表達；CCK-8細胞增殖試驗表明同空白對照組相比，P2Y11 shRNA組ATP在高濃度

8、時對HUVEC-Cs增殖的抑制作用被阻斷，而P2Y2 shRNA組ATP在高濃度時仍顯著抑制HUVEC-Cs增殖。
　　 4、Western-blot結果表明ATP在100μM時呈時間依賴性活化ERK信號通路，其誘導ERK磷酸化的時間從1min持續(xù)到Smin，其中以4～8min時最明顯，且ATP誘導的ERK磷酸化可以被其特異性阻斷劑U0126所阻斷。U0126或者PD98095均可抑制或者協(xié)同ATP抑制HUVEC-Cs增殖(P<

9、0.05)，但是并不能阻斷ATP對HUVEC-Cs增殖的抑制作用。
　　 5、流式細胞術結果表明ATP在高濃度(50，100μM)時能顯著增強順鉑誘導的細胞死亡效應(與單用順鉑組相比，P<0.05)，RT-PCR結果表明ATP在高濃度時明顯下調Bcl-2及Bcl-2家族成員包括Bcl-w、Al和Mcl-1的mRNA表達水平，Western-blot結果表明，ATP可以協(xié)同順鉑降低Bcl-2的蛋白表達水平。
　　 6、P2

10、Y11 shRNA質粒轉染HUVEC-Cs后，ATP在高濃度(50，100μM)時下調Bcl-2 mRNA表達的效應被部分阻斷，而且順鉑誘導的細胞死亡率明顯降低(P<0.05)。
　　 結論：
　　 ATP在高濃度時對HUVEC-Cs細胞增殖的抑制作用由P2Y11受體介導，該過程并不依賴于ERK信號通路的活化。高濃度的ATP通過P2Y11受體下調Bcl-2家族成員的基因表達水平，從而增強人內皮細胞對順鉑的敏感性。

11、　　 第二章胞外核苷酸對人臍血內皮祖細胞生物學功能的影響及其機制研究
　　 第一節(jié)胞外核苷酸對人臍血內皮祖細胞增殖的影響
　　 目的：
　　 分離純化臍帶血來源的單個核細胞并誘導培養(yǎng)為內皮祖細胞，觀察胞外核苷酸對其增殖的影響。
　　 方法：
　　 采用密度梯度離心法分離人臍帶血中的單個核細胞，用含有多種生長因子的內皮祖細胞專用EGM-2培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)，通過形態(tài)學、免疫熒光及逆轉錄多聚酶鏈反應(R

12、T-PCR)檢測并鑒定細胞的生物學特性；采用RT-PCR檢測靜息狀態(tài)下人內皮祖細胞(EPCs)表達的P2受體亞型，并采用不同濃度的胞外核苷酸(ATP，ADP，UTP，UDP)持續(xù)干預EPCs，通過CCK-8細胞增殖試驗檢測其對EPCs增殖的影響。
　　 結果：
　　 1、分離培養(yǎng)的內皮祖細胞早期以集落為中心呈放射狀生長，晚期形成典型的“鋪路石”樣改變，DiL-acLDL和FITC-UEA-[雙染陽性初步鑒定其為內皮祖細胞

13、。RT-PCR結果表明早期的EPCs表達較高水平的干細胞表面標志物CD133、CD31和CD34，而弱表達內皮細胞表面標志物VE-Cadherin；
　　 2、RT-PCR結果顯示靜息狀態(tài)下，EPCs表達較高水平的P2X4，6，7受體和P2Y2，4，11受體，同時也弱表達P2Y13，14受體；ATP、UTP在5μM時均能上調EPCs P2Y2受體mRNA的表達；
　　 3、與陰性對照組相比，僅ATP在高濃度(50，100

14、μM)時顯著抑制EPCs增殖，而ADP、UTP、UDP對細胞增殖均沒有明顯影響。
　　 結論：
　　 人臍血中可分離培養(yǎng)出較高純度的內皮祖細胞；高濃度的ATP顯著抑制EPCs增殖，但介導該作用的P2受體亞型有待進一步研究。
　　 第二節(jié)胞外核苷酸對LPS誘導人臍血內皮祖細胞細胞因子表達的影響及可能機制
　　 目的：
　　 觀察低濃度的ATP、UTP對LPS誘導EPCs細胞因子表達的影響并闡明其可能

15、機制。
　　 方法：
　　 采用RT-PCR檢測TLRs在EPCs中的表達情況及1mg/mL的LPS對EPCs細胞因子表達的影響；采用RT-PCR檢測不同濃度的ATP、UTP(0，5，50μM)對EPCs表達TLR4、TLR4協(xié)同受體CD14和TLR調節(jié)蛋白MyD88的影響；采用RT-PCR檢測ATP、UTP在5μM濃度時對LPS誘導EPCs細胞因子表達的影響；RT-PCR、Western-blot檢測ATP、UTP在低

16、濃度時對LPS誘導EPCs表達TLR4、CD14和MyD88的影響；Western-blot檢測ATP、UTP在低濃度時對LPS誘導EPCs NF-κB信號通路活化情況的影響。
　　 結果：
　　 1、RT-PCR結果顯示靜息狀態(tài)下，EPCs表達TLR1～10，其中TLR4的表達水平最高，其次為TLR2，TLR10和TLR3；1mg/mL的LPS能顯著上調IL-1β、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、E-選擇素、I

17、FN-α和TNF-α在EPCs中的mRNA表達水平；
　　 2、不同濃度的ATP、UTP(0，5，50μM)干預處理EPCs后，RT-PCR結果表明ATP、UTP在5μM濃度時能顯著下調TLR4、CD14和MyD88的mRNA表達；
　　 3、ATP、UTP在5μM濃度時能顯著下調LPS誘導的MCP-1，VCAM-1，IFN-α和TNF-α在EPCs中的mRNA表達水平，而對IL-1β和ICAM-1的表達無明顯影響；

18、r>　　 4、ATP、UTP在低濃度時顯著下調LPS誘導的CD14和MyD88在EPCs中的mRNA和蛋白表達水平，同時也下調LPS誘導的TLR4mRNA在EPCs中的表達；
　　 5、ATP、UTP在低濃度時顯著抑制LPS誘導的NF-κB磷酸化。
　　 結論：
　　 ATP/UTP在低濃度時能顯著抑制LPS誘導的炎癥因子和細胞因子在EPCs中的表達，該作用可能通過P2Y2受體負性調節(jié)TLR4信號通路，最終通過