人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)特征的比較研究.pdf

1、目的:
　　血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular Endothelial Cell，vEC)是一層覆蓋在血管內(nèi)壁上、參與組成血管管腔面的單層細(xì)胞，是血管壁的重要組成部分，可通過合成和分泌多種血管活性物質(zhì)參與血管活性物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)血管的收縮和舒張，從而在全身血管性疾病的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。近年來，人血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究對象以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC

2、)及人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Aortic Endothelial Cells，HAEC)為主，二者原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)均需取自一段血管內(nèi)皮，所以都存在著取材不方便的問題，而購買來的細(xì)胞株又在儲存解凍過程很容易導(dǎo)致細(xì)胞損傷，以及細(xì)胞免疫原性較高等方面的不足。
　　內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cells，EPC)是成熟內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在特定條件下可經(jīng)過誘導(dǎo)分化成為血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而具有新生血管和內(nèi)

3、皮的作用。自Asahara等于1997年發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞以來，對其的研究逐漸深入，目前普遍認(rèn)為CD34、CD133及KDR是內(nèi)皮祖細(xì)胞的表面標(biāo)志。內(nèi)皮祖細(xì)胞的主要來源有臍靜脈血、骨髓以及外周血，目前人內(nèi)皮祖細(xì)胞主要以外周血為來源進(jìn)行分離及培養(yǎng)。同血管內(nèi)皮細(xì)胞一樣，內(nèi)皮祖細(xì)胞也可在Matrigel上形成毛細(xì)血管管腔結(jié)構(gòu)，在體外培養(yǎng)過程中也可以分泌一氧化氮(N0)這種重要的內(nèi)皮依賴性舒張因子。與血管內(nèi)皮細(xì)胞相比，人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞來源更加豐富

4、，取材也更加方便，而且可以獲得細(xì)胞免疫原性比購買來的血管內(nèi)皮細(xì)胞更低的細(xì)胞，在實際應(yīng)用中可以更加符合人體情況。
　　本研究通過分析人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力、血管生成能力、一氧化氮分泌能力等生物學(xué)特征，并對所得出的結(jié)果進(jìn)行比較，以求為血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究提供新的對象或思路。
　　方法:
　　1、細(xì)胞的獲得與培養(yǎng):通過肝素抗凝管（紫頭管）采取20ml外周血后，使用密度梯度離心法分離出人外周血單個核細(xì)胞，

5、然后以EGM-2 MV培養(yǎng)基將獲取的單個核細(xì)胞重懸，接種到已經(jīng)事先用人纖維連接蛋白(FN)包被好的培養(yǎng)瓶之中，在37℃5％CO2環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，三天后換液，去除未貼壁的懸浮細(xì)胞，剩余的貼壁細(xì)胞則留下繼續(xù)培養(yǎng)，之后視細(xì)胞生長情況，大約每3天換液一次，3周左右可見培養(yǎng)瓶內(nèi)出現(xiàn)鵝卵石樣細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)對其表面抗原進(jìn)行鑒定后，確認(rèn)其為內(nèi)皮組細(xì)胞(EPC)，并以此為實驗組。購買來的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)解凍后，同樣以EGM-2 MV為

6、培養(yǎng)基，在37℃5％CO2環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，并以此為對照組。
　　2、細(xì)胞增殖能力比較:為比較內(nèi)皮祖細(xì)胞與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力，將分離培養(yǎng)獲得的內(nèi)皮祖細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞每3天換液1次。在細(xì)胞培養(yǎng)至第2，4，6和8天時，首先通過錐蟲藍(lán)染色來區(qū)別并去除無活性的細(xì)胞，然后用胰酶消化細(xì)胞，消化下來的細(xì)胞用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，然后用SPSS21.0統(tǒng)計軟件分析比較人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力是否

7、有差異。
　　3、體外血管形成實驗:為了將內(nèi)皮祖細(xì)胞的體外血管形成能力與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行比較，吸取300μ L Matrigel凝膠鋪于24孔板內(nèi)，然后孵育30分鐘，孵育環(huán)境溫度為37℃，隨后將消化下來的原代內(nèi)皮祖細(xì)胞及臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分別以5×104個同300μ L的EGM-2 MV完全培養(yǎng)基混合重懸后加入到24孔板內(nèi)，孵育12 h后，在倒置相差顯微鏡下觀察毛細(xì)血管管腔樣結(jié)構(gòu)的形成情況，拍照并使用WimTube軟件分析后得到生成

8、的管腔樣結(jié)構(gòu)的數(shù)目以及長度，然后用SPSS21.0統(tǒng)計軟件分析比較人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外血管形成能力是否有差異。
　　4、一氧化氮分泌功能測定:為比較內(nèi)皮祖細(xì)胞與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的一氧化氮分泌功能是否有差別，分別取對數(shù)生長期的人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，以5×104個細(xì)胞種植于6孔板，培養(yǎng)至第三天后，取培養(yǎng)基上清，按照一氧化氮試劑盒說明書測定上清液中的一氧化氮濃度。然后用SPSS21.0統(tǒng)計軟件分析比較

9、人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的一氧化氮分泌功能是否有差別，以及其差別是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　從外周血分離出的單個核細(xì)胞在體外經(jīng)特定的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)后，于一周左右在顯微鏡下可見細(xì)胞形成紡錘樣細(xì)胞簇，并逐漸變小消失。大約三周左右，培養(yǎng)瓶中開始出現(xiàn)鵝卵石樣外觀的細(xì)胞，且細(xì)胞逐漸融合，呈外生性生長，行流式細(xì)胞術(shù)檢測其細(xì)胞表面的特征性抗原，結(jié)果顯示所培養(yǎng)出的鵝卵石樣細(xì)胞表達(dá)CD3491.2％、CD13313.6％

10、以及KDR95.5％，證實其為內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞解凍復(fù)蘇后，細(xì)胞于培養(yǎng)瓶內(nèi)迅速貼壁，也表現(xiàn)為外生性生長。二者在同等條件下培養(yǎng)至第2、4、6、8天時進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)并比較其平均值為(1.64±0.14,1.50±0.12)×105、(3.72±0.33,3.09±0.48)×105、(8.41±0.63,6.41±0.39)×105、(12.90±0.41，10.48±0.89)×105，其差異均具有顯著性意義(P＜0.0

11、5，n=8)。體外血管形成實驗，二者形成的毛細(xì)血管管腔平均數(shù)分別為(100±12，86±10)個，管道長度平均數(shù)分別為(6.99±0.54，5.57±0.79)mm/mm2，差異均具有顯著性差異(P＜0.05，n=8)。細(xì)胞一氧化氮分泌功能測定結(jié)果顯示，培養(yǎng)三天后，人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基上清中一氧化氮濃度分別為(1.81±0.40，2.53±0.28)μmol/L，其差異具有顯著性意義(P＜0.05，n=8)。