人外周血內皮祖細胞與臍靜脈內皮細胞生物學特征的比較研究.pdf

1、目的:
　　血管內皮細胞(vascular Endothelial Cell，vEC)是一層覆蓋在血管內壁上、參與組成血管管腔面的單層細胞，是血管壁的重要組成部分，可通過合成和分泌多種血管活性物質參與血管活性物質代謝的調節(jié)，調節(jié)血管的收縮和舒張，從而在全身血管性疾病的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。近年來，人血管內皮細胞的研究對象以人臍靜脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC

2、)及人主動脈內皮細胞(Human Aortic Endothelial Cells，HAEC)為主，二者原代細胞的分離培養(yǎng)均需取自一段血管內皮，所以都存在著取材不方便的問題，而購買來的細胞株又在儲存解凍過程很容易導致細胞損傷，以及細胞免疫原性較高等方面的不足。
　　內皮祖細胞(Endothelial Progenitor Cells，EPC)是成熟內皮細胞的前體細胞，在特定條件下可經(jīng)過誘導分化成為血管內皮細胞，從而具有新生血管和內

3、皮的作用。自Asahara等于1997年發(fā)現(xiàn)內皮祖細胞以來，對其的研究逐漸深入，目前普遍認為CD34、CD133及KDR是內皮祖細胞的表面標志。內皮祖細胞的主要來源有臍靜脈血、骨髓以及外周血，目前人內皮祖細胞主要以外周血為來源進行分離及培養(yǎng)。同血管內皮細胞一樣，內皮祖細胞也可在Matrigel上形成毛細血管管腔結構，在體外培養(yǎng)過程中也可以分泌一氧化氮(N0)這種重要的內皮依賴性舒張因子。與血管內皮細胞相比，人外周血內皮祖細胞來源更加豐富

4、，取材也更加方便，而且可以獲得細胞免疫原性比購買來的血管內皮細胞更低的細胞，在實際應用中可以更加符合人體情況。
　　本研究通過分析人外周血內皮祖細胞與人臍靜脈內皮細胞的增殖能力、血管生成能力、一氧化氮分泌能力等生物學特征，并對所得出的結果進行比較，以求為血管內皮細胞的研究提供新的對象或思路。
　　方法:
　　1、細胞的獲得與培養(yǎng):通過肝素抗凝管（紫頭管）采取20ml外周血后，使用密度梯度離心法分離出人外周血單個核細胞，

5、然后以EGM-2 MV培養(yǎng)基將獲取的單個核細胞重懸，接種到已經(jīng)事先用人纖維連接蛋白(FN)包被好的培養(yǎng)瓶之中，在37℃5％CO2環(huán)境下進行培養(yǎng)，三天后換液，去除未貼壁的懸浮細胞，剩余的貼壁細胞則留下繼續(xù)培養(yǎng)，之后視細胞生長情況，大約每3天換液一次，3周左右可見培養(yǎng)瓶內出現(xiàn)鵝卵石樣細胞，通過流式細胞術對其表面抗原進行鑒定后，確認其為內皮組細胞(EPC)，并以此為實驗組。購買來的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)解凍后，同樣以EGM-2 MV為

6、培養(yǎng)基，在37℃5％CO2環(huán)境下進行培養(yǎng)擴增，并以此為對照組。
　　2、細胞增殖能力比較:為比較內皮祖細胞與臍靜脈內皮細胞的增殖能力，將分離培養(yǎng)獲得的內皮祖細胞和人臍靜脈內皮細胞接種于6孔板，細胞每3天換液1次。在細胞培養(yǎng)至第2，4，6和8天時，首先通過錐蟲藍染色來區(qū)別并去除無活性的細胞，然后用胰酶消化細胞，消化下來的細胞用細胞計數(shù)板進行計數(shù)，然后用SPSS21.0統(tǒng)計軟件分析比較人外周血內皮祖細胞與人臍靜脈內皮細胞的增殖能力是否

7、有差異。
　　3、體外血管形成實驗:為了將內皮祖細胞的體外血管形成能力與臍靜脈內皮細胞進行比較，吸取300μ L Matrigel凝膠鋪于24孔板內，然后孵育30分鐘，孵育環(huán)境溫度為37℃，隨后將消化下來的原代內皮祖細胞及臍靜脈內皮細胞分別以5×104個同300μ L的EGM-2 MV完全培養(yǎng)基混合重懸后加入到24孔板內，孵育12 h后，在倒置相差顯微鏡下觀察毛細血管管腔樣結構的形成情況，拍照并使用WimTube軟件分析后得到生成

8、的管腔樣結構的數(shù)目以及長度，然后用SPSS21.0統(tǒng)計軟件分析比較人外周血內皮祖細胞與人臍靜脈內皮細胞的體外血管形成能力是否有差異。
　　4、一氧化氮分泌功能測定:為比較內皮祖細胞與臍靜脈內皮細胞的一氧化氮分泌功能是否有差別，分別取對數(shù)生長期的人外周血內皮祖細胞和人臍靜脈內皮細胞，以5×104個細胞種植于6孔板，培養(yǎng)至第三天后，取培養(yǎng)基上清，按照一氧化氮試劑盒說明書測定上清液中的一氧化氮濃度。然后用SPSS21.0統(tǒng)計軟件分析比較

9、人外周血內皮祖細胞和人臍靜脈內皮細胞的一氧化氮分泌功能是否有差別，以及其差別是否具有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　從外周血分離出的單個核細胞在體外經(jīng)特定的培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)后，于一周左右在顯微鏡下可見細胞形成紡錘樣細胞簇，并逐漸變小消失。大約三周左右，培養(yǎng)瓶中開始出現(xiàn)鵝卵石樣外觀的細胞，且細胞逐漸融合，呈外生性生長，行流式細胞術檢測其細胞表面的特征性抗原，結果顯示所培養(yǎng)出的鵝卵石樣細胞表達CD3491.2％、CD13313.6％

10、以及KDR95.5％，證實其為內皮祖細胞(EPC)。人臍靜脈內皮細胞解凍復蘇后，細胞于培養(yǎng)瓶內迅速貼壁，也表現(xiàn)為外生性生長。二者在同等條件下培養(yǎng)至第2、4、6、8天時進行細胞計數(shù)并比較其平均值為(1.64±0.14,1.50±0.12)×105、(3.72±0.33,3.09±0.48)×105、(8.41±0.63,6.41±0.39)×105、(12.90±0.41，10.48±0.89)×105，其差異均具有顯著性意義(P＜0.0

11、5，n=8)。體外血管形成實驗，二者形成的毛細血管管腔平均數(shù)分別為(100±12，86±10)個，管道長度平均數(shù)分別為(6.99±0.54，5.57±0.79)mm/mm2，差異均具有顯著性差異(P＜0.05，n=8)。細胞一氧化氮分泌功能測定結果顯示，培養(yǎng)三天后，人外周血內皮祖細胞和人臍靜脈內皮細胞培養(yǎng)基上清中一氧化氮濃度分別為(1.81±0.40，2.53±0.28)μmol/L，其差異具有顯著性意義(P＜0.05，n=8)。