當歸多糖抑制正常大鼠及慢性炎癥貧血(ACD)大鼠hepcidin表達的研究.pdf

1、鐵調(diào)素(hepcidin)由肝細胞分泌的25個氨基酸抗菌肽組成,是維持機體鐵穩(wěn)態(tài)的一種關鍵性―核心負性調(diào)節(jié)因子‖,在鐵轉移通路中發(fā)揮著主要作用。當機體hepcidin受抑制時,腸道鐵吸收及巨噬細胞鐵釋放增加,使更多的鐵離子可被吸收并利用來造血。本課題組已通過實驗證明,給藥當歸多糖(ASP)兩周以后,正常大鼠肝臟中hepcidin的表達水平明顯下降。本次實驗主要目的是研究當歸多糖抑制正常大鼠hepcidin的表達是否具有量效依賴關系,以及

2、當歸多糖抑制正常大鼠hepcidin表達的分子機制。
　　臨床檢測發(fā)現(xiàn)慢性炎癥貧血患者體內(nèi)hepcidin含量顯著升高,為進一步研究當歸多糖能否通過下調(diào)hepcidin的含量對慢性炎癥貧血發(fā)揮治療作用,我們采用足跖注射弗氏完全佐劑建立慢性炎癥貧血(ACD)大鼠模型。檢測灌胃不同濃度當歸多糖后ACD大鼠體內(nèi)hepcidin、血常規(guī)、血清鐵及炎性因子等指標的變化,研究當歸多糖調(diào)節(jié)ACD大鼠hepcidin表達的分子機制。
　　第

3、一部分不同濃度當歸多糖對正常大鼠體內(nèi)hepcidin表達的抑制作用及分子機制研究
　　采用傳統(tǒng)的水煮法從當歸飲片中提取當歸多糖,合并得到的兩次水提液。水提液中加入一定量的Ca(OH)2生成絮狀沉淀,除去蛋白質(zhì)、鞣酸等雜質(zhì)。濾液加濃硫酸調(diào)節(jié)PH至5—6,既能除雜又調(diào)整了溶液PH,在60℃烘箱中烘干成浸膏狀。采用5％苯酚—硫酸法測定當歸浸膏的糖含量,用無水葡萄糖配制對照品溶液,繪制標準曲線計算得浸膏糖含量均在70%以上,滿足灌胃給藥的

4、要求。
　　將48只健康SD雄性大鼠,隨機分成6組,每組8只。陰性對照組每天灌胃生理鹽水1mL,連續(xù)給藥20天;陽性對照組分為低劑量組(腹腔注射rhEPO800U/kg)和高劑量組(腹腔注射rhEPO2000U/kg),每日注射一次連續(xù)給藥3天。實驗組大鼠分低、中、高三個劑量,分別灌胃0.3g/kg、0.6g/kg和1.2g/kg當歸多糖20天。給藥前及給藥完成后分別對各大鼠進行一次眼眶取血,用于測定血液相關指標的含量變化。將大鼠

5、處死后取肝臟,烘干至恒重測定肝臟鐵含量。結果發(fā)現(xiàn)灌胃0.3g/kg、0.6g/kg和1.2g/kg當歸多糖組大鼠與給藥前相比,血清hepcidin含量分別下降了19.4%,27.1%和31.2%。隨著當歸多糖給藥劑量的增加,對hepcidin的抑制作用增強。腹腔注射rhEPO800U/kg和rhEPO2000U/kg的正常大鼠,血清hepcidin分別下降了24.3%和29.5%。與陰性對照組相比,rhEPO兩個劑量組的紅細胞、血紅蛋白

6、含量均顯著升高,而低、中、高三個當歸多糖劑量組的紅細胞、血紅蛋白含量無明顯變化。陰性對照組血清鐵含量為2.71±0.53mg/L,800U/kgrhEPO和2000U/kgrhEPO組大鼠血清鐵含量分別為2.08±0.39mg/L、1.70±0.18mg/L,與陰性對照組比較,EPO顯著降低血清鐵含量。實驗組中只有高劑量(1.2g/kg)當歸多糖組血清鐵含量顯著降低,為1.68±0.27mg/L。陽性對照組的肝臟鐵含量也顯著降低,同時1

7、.2g/kg當歸多糖大鼠肝臟鐵含量出現(xiàn)明顯的下降,這是因為鐵在機體中重新分配以滿足紅細胞生成的需要。
　　從正常大鼠肝臟提取組織蛋白液,蛋白免疫印跡法(westernblot)檢測信號因子含量。結果顯示,ASP通過下調(diào)肝細胞JAK2總蛋白含量,使得p-JAK2相應減少。與JAK2總蛋白含量相比,2000U/kgrhEPO給藥組大鼠的p-JAK2含量顯著降低,說明EPO主要抑制JAK2蛋白磷酸化過程而不是抑制總蛋白JAK2的表達。A

8、SP和rhEPO均能顯著下調(diào)p-SMAD1/5/8含量,使得進入細胞核內(nèi)與hepcidin基因啟動子相結合的磷酸化二聚物合成受阻,抑制hepcidin的表達。與陰性對照組相比,ASP和rhEPO給藥組的信號蛋白Erk1/2和TMPRSS6含量無明顯變化,說明ASP和rhEPO不能通過Erk1/2和TMPRSS6途徑抑制hepcidin表達。
　　第二部分不同濃度當歸多糖對ACD大鼠體內(nèi)hepcidin表達的抑制作用及分子機制研究<

9、br>　　SD雄性大鼠足跖注射100ul含10mg/ml結核分枝桿菌的弗氏完全佐劑(CFA),建立慢性炎癥貧血(ACD)模型。注射側后足在給藥后出現(xiàn)原發(fā)性腫脹,非注射對側足和前足在注射后第十天繼發(fā)腫脹發(fā)生明顯,耳朵、尾巴紅腫甚至出現(xiàn)關節(jié)炎“結節(jié)”等繼發(fā)病變。與對照組相比,模型組大鼠紅細胞、血紅蛋白和血清鐵含量降低,分別為6.06×1012/L,92.4g/L和1.78mg/L,而炎癥相關指標如白細胞計數(shù)、IL-6和TNF-α含量顯著升高

10、,分別為2.58×1010/L,84.10pg/ml和68.34pg/ml,弗氏完全佐劑建立的模型符合ACD的發(fā)病特征。
　　治療ACD的關鍵是抗炎以及改善貧血,實驗組的ACD大鼠每天分別灌胃0.5g/kg和1.0g/kg的當歸多糖,連續(xù)給藥4周。陽性對照組是每天給ACD大鼠灌胃10mg/kg雙氯芬酸鈉,連續(xù)給藥4周。測量足腫脹,以及檢測血常規(guī)、hepcidin、血清鐵和炎性因子等指標。高劑量當歸多糖組(1.0g/kg)比低劑量當

11、歸多糖組(0.5g/kg)抑制ACD大鼠hepcidin表達的作用強,抑制率分別為43.1%和28.7%。與模型組大鼠相比,雙氯芬酸鈉組的血清hepcidin含量也顯著降低了38.0%。雙氯芬酸鈉抑制ACD大鼠原發(fā)性足腫脹和繼發(fā)性足腫脹的作用均強于1.0g/kg當歸多糖高劑量組。模型組大鼠白細胞計數(shù)2.58×1010/L,給藥雙氯芬酸鈉和1.0g/kg當歸多糖治療后白細胞含量顯著下降,分別為1.59×1010/L和1.77×1010/L

12、。雙氯芬酸鈉和當歸多糖均能顯著下調(diào)ACD大鼠血清炎性因子IL-6和TNF-α的含量,并且雙氯芬酸鈉的抑制作用更顯著。觀察足部X光和滑膜蘇木素-伊紅(H-E)染色切片發(fā)現(xiàn)雙氯芬酸鈉對大鼠關節(jié)保護、下調(diào)炎癥細胞含量的作用最顯著。這說明雙氯芬酸鈉對ACD大鼠的抗炎作用強于1.0g/kg當歸多糖。模型組大鼠紅細胞計數(shù)6.06×1012/L,給藥雙氯芬酸鈉和1.0g/kg當歸多糖治療后紅細胞含量顯著升高,分別為7.68×1012/L和8.16×1

13、012/L。1.0g/kg當歸多糖治療的ACD大鼠不僅紅細胞含量明顯增加,與模型組比較,其血紅蛋白和血清鐵等鐵代謝相關指標含量也顯著升高,這表明當歸多糖(1.0g/kg)對ACD大鼠的―補血補鐵‖效果十分顯著。高劑量當歸多糖對ACD大鼠的治療作用強于當歸多糖低劑量組。
　　Westernblot結果顯示,當歸多糖和雙氯芬酸鈉均能通過下調(diào)ACD大鼠肝臟信號蛋白JAK2、STAT3和p-SMAD1/5/8含量抑制hepcidin的表達