當(dāng)歸多糖參與正常機(jī)體鐵代謝的分子機(jī)制研究.pdf

1、鐵調(diào)素hepcidin是機(jī)體鐵代謝中關(guān)鍵的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。Hepcidin的表達(dá)異常會(huì)引起體內(nèi)鐵缺乏或鐵超載，進(jìn)而引發(fā)一系列與鐵代謝紊亂有關(guān)的疾病。Hepcidin調(diào)節(jié)劑的發(fā)現(xiàn)和研制將為鐵代謝障礙性疾病的防治提供新的方向和途徑。本實(shí)驗(yàn)室前期研究得出，當(dāng)歸中的主要活性成分當(dāng)歸多糖可參與機(jī)體鐵代謝增加腸道鐵吸收，推測(cè)與hepcidin的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。為進(jìn)一步探討當(dāng)歸多糖參與正常機(jī)體鐵代謝的作用，本實(shí)驗(yàn)研究了當(dāng)歸多糖對(duì)正常大鼠體內(nèi)hepcidi

2、n表達(dá)的抑制作用及具體抑制機(jī)理；并建立了人hepcidin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞系，為當(dāng)歸多糖直接作用腸道鐵吸收的體外研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 第一部分 當(dāng)歸多糖對(duì)正常大鼠體內(nèi)hepcidin表達(dá)的抑制作用及分子機(jī)制研究
　　 對(duì)當(dāng)歸多糖抑制hepcidin表達(dá)的活性進(jìn)行探討，并對(duì)其抑制機(jī)制進(jìn)行研究。采用水提，酸堿除蛋白的方法提取當(dāng)歸飲片中的當(dāng)歸總多糖。所得到的產(chǎn)物糖含量穩(wěn)定保持在70％以上，不同批次間重復(fù)性好，為后期

3、的藥理實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。
　　 以腹腔注射rhEPO（2000IU/kg，q.d.×3）為陽(yáng)性對(duì)照，灌胃生理鹽水（1mL，q.d.×14）為陰性對(duì)照，對(duì)大鼠每天灌胃當(dāng)歸多糖溶液（1g/kg），給藥14d；于給藥前及末次給藥后不同時(shí)間點(diǎn)，大鼠內(nèi)眥取血，ELISA法檢測(cè)血清中EPO和hepcidin的含量。SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分析當(dāng)歸多糖刺激機(jī)體內(nèi)源性EPO分泌的藥效時(shí)間關(guān)系，以及抑制hepcidin表達(dá)的活性與宏觀抑制機(jī)制。實(shí)驗(yàn)

4、結(jié)果表明當(dāng)歸多糖可顯著提高體內(nèi)EPO分泌水平，給藥后4h達(dá)到最高值；同EPO一樣，當(dāng)歸多糖也可顯著抑制hepcidin表達(dá)，hepcidin受抑制程度與體內(nèi)EPO分泌的激活程度呈正相關(guān)。當(dāng)歸多糖具有抑制hepcidin表達(dá)的藥理作用，初步推測(cè)其主要抑制機(jī)制是通過(guò)刺激機(jī)體總紅細(xì)胞生成活性的類EPO途徑，此研究結(jié)果為進(jìn)一步研究當(dāng)歸多糖抑制hepcidin表達(dá)的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。
　　 考察當(dāng)歸多糖及EPO對(duì)hepcidin主要調(diào)控通

5、路中關(guān)鍵信號(hào)分子的作用活性，包括：JAK-STAT通路中的STAT3/5和pSTAT3/5、HJV/BMP-SMAD途徑中的SMAD4以及紅細(xì)胞生成調(diào)控途徑中的C/EBPα，以闡明當(dāng)歸多糖抑制hepcidin的具體分子機(jī)制。另取一批大鼠，進(jìn)行同上分組及給藥。陽(yáng)性對(duì)照組（rhEPO組）末次給藥8 h后，實(shí)驗(yàn)組（ASP組）及陰性對(duì)照組末次給藥24 h后，大鼠淺麻醉，肝臟在體灌注以除去血液，western blot檢測(cè)肝臟內(nèi)目標(biāo)信號(hào)蛋白的表達(dá)

6、水平。采用圖像分析軟件Image Plus Pro 6.0 對(duì)顯影膠片進(jìn)行分析，SPSS軟件進(jìn)行組間差異顯著性分析。初步得出當(dāng)歸多糖與EPO抑制hepcidin表達(dá)的具體機(jī)制如下圖所示：
　　 圖I 當(dāng)歸多糖及EPO抑制hepcidin表達(dá)的分子機(jī)制
　　 當(dāng)歸多糖（ASP）通過(guò)下調(diào)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子STAT3/5及SMAD4的表達(dá)量，并通過(guò)刺激內(nèi)源性EPO分泌而進(jìn)一步下調(diào)肝細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白水平，最終抑制hepcidin表達(dá)；E

7、PO則通過(guò)減弱JAK激酶引起的STAT3/5磷酸化、下調(diào)C/EBPα和SMAD4的含量，從而導(dǎo)致激動(dòng)因子減少，HAMP啟動(dòng)子活性減弱，hepcidin表達(dá)下降。
　　 第二部分 腸道鐵吸收調(diào)控模型--人hepcidin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞系的構(gòu)建
　　 構(gòu)建人hepcidin全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)基因真核表達(dá)載體，建立穩(wěn)定高表達(dá)hepcidin的HepG2細(xì)胞系，以應(yīng)用于當(dāng)歸多糖參與腸道鐵吸收調(diào)控的體外研究?；瘜W(xué)合成結(jié)合PCR擴(kuò)增拼

8、接hepcidin 全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)基因，插入原核表達(dá)載體pMD18-T中，測(cè)序正確后再經(jīng)HindⅢ與EcoRⅠ雙酶切，定向插入真核表達(dá)載體pcDNA3.0內(nèi)，酶切鑒定后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人HepG2細(xì)胞，G418選擇抗性細(xì)胞克隆，ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞hepcidin的蛋白表達(dá)。經(jīng)酶切鑒定，成功構(gòu)建hepcidin真核表達(dá)載體pcDNA3-hepcidin；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2，經(jīng)G418篩選3周獲得抗性細(xì)胞克隆，其hepci