阿爾茨海默病大鼠模型的磁共振、行為學、電生理、形態(tài)學和分子生物學研究.pdf

1、目的：
　　阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease, AD）是一種嚴重影響老年人身體健康的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，起病隱匿，主要表現(xiàn)為進行性認知功能障礙、學習和記憶能力喪失，晚期出現(xiàn)嚴重的癡呆。目前我國癡呆患者的人數(shù)約600萬，居世界第一位。而且隨著人口老齡化的加劇，AD的發(fā)病率和患者人數(shù)還會持續(xù)增加，因此，對于 AD的早期診斷和治療具有重要的臨床意義。同時，目前臨床工作中常常根據(jù)臨床表現(xiàn)結合磁共振成像內(nèi)側顳葉萎縮視

2、覺量表診斷AD。但是，只有中、晚期AD患者才會出現(xiàn)腦萎縮改變，如何在AD患者出現(xiàn)臨床癥狀和腦組織形態(tài)改變之前早期發(fā)現(xiàn)和診斷AD，目前尚無有效方法。
　　AD的典型病理特征包括高密度老年斑、神經(jīng)原纖維纏結和神經(jīng)元喪失。老年斑的核心成分是由39-43個氨基酸組成的β-淀粉樣蛋白（β-amyloid peptides, Aβ）。大量研究表明，Aβ分子的產(chǎn)生和異常沉積是 AD發(fā)病的始動因素，AD病程中所出現(xiàn)的神經(jīng)原纖維纏結的形成和神經(jīng)元死

3、亡等一系列過程，均是Aβ所引起的繼發(fā)過程。此外，位于19號染色體的載脂蛋白E4（apolipoprotein E4, APOE4）基因是AD的主要危險因子，APOE4基因過表達后的產(chǎn)物apoE4也已經(jīng)被證明具有較強的神經(jīng)毒性，并與AD的發(fā)生發(fā)展有著不可忽視的關系。同時，不僅Aβ和apoE4本身具有神經(jīng)毒性作用，apoE4和Aβ之間還具有協(xié)同作用，能夠進一步加重AD的發(fā)生發(fā)展。
　　磁共振成像（magnetic resonance

4、imaging, MRI）是一種具有極高的軟組織分辨力，廣泛應用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究與診斷的影像學檢查手段。Morris水迷宮是在神經(jīng)科學研究中廣泛應用的，能夠有效反映動物的認知功能改變和衡量動物學習記憶功能的經(jīng)典行為學實驗手段。海馬長時程增強（long-term potentiation, LTP）則是研究學習記憶和AD發(fā)病機制的一個重要的電生理細胞模型。已有研究發(fā)現(xiàn)Aβ1-40可以直接引起大鼠側腦室擴大、磁共振波譜成像化合物濃度改變

5、、損傷大鼠空間學習記憶能力和壓抑LTP的誘導和維持；還有研究表明人類APOE4基因目標替換小鼠的空間學習記憶能力和工作記憶能力均有不同程度的損傷，海馬腦片 LTP被明顯壓抑。但目前仍缺乏Aβ和apoE4共同作用的影像學表現(xiàn)特點、對空間學習記憶能力和海馬突觸可塑性影響的報道，尤其是缺乏在同一動物模型先后進行磁共振、行為學、電生理和形態(tài)學等多種不同檢查和實驗，從不同角度闡述AD相關病變，并最終從病理學角度證實AD的相關研究。
　　本研

6、究利用磁共振檢查、Morris水迷宮行為學檢測和在體場電位記錄，結合相關的形態(tài)學和分子生物學檢測手段，通過在造模前和造模后不同時間點檢測三種不同AD模型的T2值、1H-MRS指標變化，同時觀察其空間學習記憶能力和突觸可塑性的改變，并最終進行病理學相關檢測，探討不同AD模型磁共振、行為學、電生理、形態(tài)學的變化及其關系。通過對三種不同AD模型先后采用多種手段從不同角度檢測其AD相關病變，特別是觀察不同AD大鼠模型磁共振影像學變化特點，希望有

7、助于進一步認識AD病程中各種病變的發(fā)生發(fā)展及其相互聯(lián)系，從而為AD早期診斷的準確性和敏感性提供新的依據(jù)和方法。
　　方法：
　　以側腦室單獨注射Aβ1-40或apoE4、以及聯(lián)合注射Aβ1-40和apoE4三種方法制備的AD模型大鼠為研究對象。將60只大鼠隨機分為空白對照組、Aβ1-40組、ApoE4組和聯(lián)合給藥組，每組15只。利用磁共振多回波序列和波譜成像技術，在給藥前、給藥后2周和4周對四組大鼠分別進行頭顱MRI掃描，縱

8、向研究大鼠海馬T2值和1H-MRS化合物濃度的變化。利用Morris水迷宮行為學技術，在第二次磁共振檢查結束后，對各組大鼠進行定位航行實驗、空間探索實驗和可視平臺實驗，觀察大鼠搜索水下平臺的平均逃避潛伏期和游泳距離、在目標象限游泳的時間和距離占總游泳時間和距離的百分比，以及平均游泳速度和尋找可視平臺的逃避潛伏期等指標的變化。在水迷宮實驗結束后，使用在體場電位記錄手段直接記錄各組大鼠海馬CA1區(qū)基礎fEPSPs、PPF和LTP等指標的變化

9、，以觀察各組基礎突觸傳遞和突觸可塑性的變化特征。在第三次磁共振檢查結束后，從各組隨機選取部分大鼠進行HE染色和免疫組織化學檢測，從整體上觀察各組大鼠腦的形態(tài)學改變，并觀察海馬和皮層Aβ免疫陽性細胞的數(shù)量。同時，從各組隨機選取部分大鼠，采用western blot技術檢測其海馬組織磷酸化tau蛋白的含量。
　　結果：
　　利用磁共振多回波序列和波譜成像技術，在給藥前后不同時間點對四組大鼠分別進行頭顱MRI掃描，發(fā)現(xiàn)：（1）三種

10、AD模型大鼠海馬T2值改變特點不同。在給藥前及給藥后2周和4周，對照組 T2值分別為80.46±3.06 ms、81.92±3.48 ms和80.72±3.47 ms，ApoE4組的T2值則分別為80.64±2.27 ms、81.20±1.67 ms和81.98±3.10 ms。ApoE4組大鼠海馬 T2值與對照組在不同時間點均無明顯差異，且不同時間點ApoE4組T2值也無差異。Aβ1-40組的 T2值在給藥前及給藥后2周和4周分別為8

11、1.70±3.10 ms、80.59±3.22 ms和91.05±3.10 ms。在給藥前和給藥后2周，Aβ1-40組與對照組 T2值均無明顯差異。但在給藥后4周，Aβ1-40組 T2值明顯高于對照組（P<0.05）。同時，Aβ1-40組大鼠在給藥后4周的T2值明顯高于本組給藥前和給藥后2周（P<0.05）。在聯(lián)合給藥組，給藥前及給藥后2周和4周，海馬T2值分別為80.86±2.74 ms、81.71±3.55 ms和95.95±1.2

12、5 ms。給藥后2周，三種AD模型大鼠的T2值與對照組均無顯著性差異；但在給藥后4周，聯(lián)合給藥組的T2值不僅明顯高于對照組，也高于單獨給予Aβ1-40或apoE4組（P<0.05）。同時，聯(lián)合給藥組在給藥后4周的 T2值明顯高于給藥前和給藥后2周（P<0.05）。（2）三種 AD大鼠模型海馬NAA/Cr+Cr1均減低，但程度不同。給藥前，對照組、Aβ1-40組、ApoE4組及聯(lián)合給藥組的NAA/Cr+Cr1分別為1.19±0.06、1.

13、15±0.12、1.16±0.05和1.16±0.07；在給藥后2周，Aβ1-40組、ApoE4組及聯(lián)合給藥組的NAA/Cr+Cr1分別為0.74±0.13、0.92±0.17和0.33±0.12，均較對照組的1.16±0.04降低（P<0.05）；給藥后4周，Aβ1-40組、ApoE4組及聯(lián)合給藥組的 NAA/Cr+Cr1分別為0.44±0.04、0.73±0.04和0.18±0.02，同樣均較對照組的1.20±0.10降低（P<0.

14、05）；且在給藥后不同時間點，均以聯(lián)合給藥組降低最顯著，ApoE4組降低最少。同時，三種AD大鼠模型在給藥后4周的NAA/Cr+Cr1均低于給藥后2周，給藥后2周的NAA/Cr+Cr1又低于給藥前（P<0.05）。（3）三種AD大鼠模型均有海馬 Cho/Cr+Cr1減低，但特點不同。在對照組，給藥前及給藥后的2周和4周，Cho/Cr+Cr1分別為1.30±0.13、1.27±0.08和1.28±0.05。在Aβ1-40組、ApoE4組及

15、聯(lián)合給藥組，給藥后2周和4周海馬 Cho/Cr+Cr1分別為1.01±0.31和0.81±0.16、0.95±0.25和0.84±0.09、0.96±0.28和0.85±0.23，與相同時間點對照組比較均明顯降低（P<0.05），但三種 AD模型之間無明顯差異。此外，在給藥后不同時間點（2周和4周），各AD模型組Cho/Cr+Cr1與本組給藥前相比均明顯減?。≒<0.05）；同時，Aβ1-40組Cho/Cr+Cr1在給藥后4周明顯低于給

16、藥后2周（P<0.05），但ApoE4組和聯(lián)合給藥組大鼠Cho/Cr+Cr1在給藥后2周與4周相比均無明顯差異。（4）三種AD模型海馬NAA/Cho的改變特點不同。給藥后2周，聯(lián)合給藥組大鼠海馬NAA/Cho為0.38±0.21，明顯低于對照組的0.91±0.08（P<0.05），但 Aβ1-40組和 ApoE4組的NAA/Cho分別為0.81±0.34和1.02±0.33，與對照組無明顯差異。給藥后4周，Aβ1-40組和聯(lián)合給藥組NA

17、A/Cho分別為0.58±0.21和0.24±0.14，與對照組的0.94±0.07相比均明顯降低，且以聯(lián)合給藥組降低更為明顯（P<0.05）。同時，在給藥后2周，聯(lián)合給藥組大鼠海馬NAA/Cho與給藥前的0.91±0.21相比明顯降低（P<0.05），且降低程度與給藥后4周無統(tǒng)計學差異。但Aβ1-40組NAA/Cho在給藥后4周才明顯低于對照組，ApoE4組則始終與給藥前無明顯差異。
　　第二次磁共振實驗后，進行 Morris水

18、迷宮行為學實驗，發(fā)現(xiàn)：（1）側腦室單獨注射Aβ1-40或apoE4均明顯損傷大鼠空間學習記憶能力，但二者對大鼠空間學習記憶能力損傷的程度無明顯差別。在定位航行實驗訓練的第1天，側腦室注射Aβ1-40或apoE4與對照組相比，其空間學習能力無明顯差異。但在第2-5天，Aβ1-40組大鼠的平均逃避潛伏期和平均游泳距離分別為35.7±1.8 s和832.4±55.4 cm、29.4±1.6 s和554.3±54.9 cm、23.8±1.4 s

19、和459.0±39.0 cm、23.1±1.3 s和405.1±45.7 cm；ApoE4組大鼠的平均逃避潛伏期和平均游泳距離分別為35.1±2.0 s和826.3±70.4 cm、28.6±2.1 s和557.3±53.7 cm、24.0±2.7 s和456.1±33.5 cm、23.4±1.9 s和404.6±45.8 cm。兩種AD模型的平均逃避潛伏期和平均游泳距離與對照組第2-5天的26.4±3.8 s和609.0±67.1 c

20、m、21.3±3.5 s和360.2±37.4 cm、16.1±2.8 s和267.4±32.3 cm、14.8±2.5 s和260.3±34.2 cm相比，均明顯延長（P<0.05）。在空間探索實驗中，Aβ1-40組和ApoE4組大鼠在目標象限游泳的時間和距離占總游泳時間和距離的百分比分別為34.6±1.9％和34.1±2.4%、34.4±1.6%和34.0±2.2%，均明顯低于對照組的46.3±3.8%和46.1±3.5%（P<0.

21、01）。同時，在定位航行和空間探索實驗中，兩種AD模型的空間學習記憶能力損傷均無明顯差異。（2）側腦室聯(lián)合注射Aβ1-40和apoE4明顯損傷大鼠的空間學習記憶能力，且其作用強于單獨給予Aβ1-40或apoE4。在定位航行實驗第1天，聯(lián)合給藥組與對照組以及單獨給予Aβ1-40或apoE4組相比，均無明顯差異。第2天，聯(lián)合給藥組大鼠搜索水下平臺的平均逃避潛伏期和游泳距離分別為41.1±2.5 s和905.4±80.8 cm，與對照組相比明

22、顯延長（P<0.05），但與單獨給予Aβ1-40或apoE4組相比無明顯差異。在第3-5天，聯(lián)合給藥組大鼠的空間學習能力與單獨注射Aβ1-40或apoE4組相比也有明顯損傷，其搜索水下平臺的平均逃避潛伏期和游泳距離分別為36.0±1.1 s和782.1±71.7 cm、30.7±1.8 s和621.7±39.3 cm、29.8±1.7 s和588.8±34.1 cm。在空間探索實驗中，聯(lián)合給藥組大鼠在目標象限游泳的時間和距離占總游泳時間

23、和距離的百分比為27.3±1.8%和26.7±1.3%，不僅明顯低于對照組（P<0.01），也明顯低于單獨給予Aβ1-40或apoE4組（P<0.01）。（3）所有藥物均未影響大鼠的視力和運動能力。在連續(xù)5天的空間學習訓練過程中，各組大鼠的平均游泳速度和尋找可視平臺的逃避潛伏期均無明顯差異。對照組、Aβ1-40組、ApoE4組和聯(lián)合給藥組的平均游泳速度分別為19.2±1.6 cm/s、19.2±1.7 cm/s、19.4±1.9 cm/

24、s和119.2±1.8 cm/s；到達可視平臺的平均時間分別為12.6±0.9 s、112.3±0.8 s、12.7±0.8 s和12.3±0.9 s。
　　Morris水迷宮實驗結束后，對大鼠海馬的在體場電位進行記錄，結果表明：（1）側腦室單獨注射Aβ1-40或apoE4均明顯損傷海馬CA1區(qū)LTP，但二者對LTP的壓抑作用無統(tǒng)計學差異。在給予高頻刺激（high frequency stimulation, HFS）前，各組的基

25、礎fEPSPs幅度始終較穩(wěn)定，基礎突觸傳遞未被影響。當給予HFS后，對照組fEPSPs的幅值立即明顯上升到177.8±4.9%，并在HFS后60分鐘仍保持在149.3±4.1%。在Aβ1-40組，給予HFS后0分鐘、30分鐘和60分鐘，fEPSPs的幅值分別為147.9±5.8%、123.4±4.1%和117.7±3.8%，與對照組相比，均顯示出明顯的壓抑（P<0.01）；在ApoE4組，給予HFS后0分鐘、30分鐘和60分鐘，fEPS

26、Ps的幅值分別為144.4±6.1%、122.8±4.4%和122.4±3.3%，與對照組相比同樣被明顯壓抑（P<0.01）；但在HFS后不同時間點，兩種AD模型對LTP的壓抑程度無顯著差異。（2）側腦室聯(lián)合注射Aβ1-40和apoE4明顯損傷海馬LTP，且其作用強于單獨注射Aβ1-40或apoE4。聯(lián)合給藥并未損傷基礎突觸傳遞，但在給予HFS后0分鐘、30分鐘和60分鐘，fEPSPs幅值分別為146.5±4.1%、113.6±3.2%

27、和105.0±3.8%，在各時間點與對照組相比均有明顯壓抑（P<0.01）。同時，在HFS后0分鐘和30分鐘，聯(lián)合給藥組大鼠fEPSPs的幅值與Aβ1-40組或ApoE4組相比無明顯差異；但在HFS后60分鐘，聯(lián)合給藥組LTP的壓抑程度明顯大于單獨應用Aβ1-40（P<0.05）或apoE4（P<0.01）組。（3）三種AD模型海馬雙脈沖易化均未受到影響。在對照組、Aβ1-40組、ApoE4組及聯(lián)合給藥組，海馬CA1區(qū)的PPF值分別為1

28、94.5±6.1%、196.8±7.5%、193.1±6.8%和194.9±5.4%，各組的PPF值無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。
　　第三次磁共振檢查結束后，進行HE染色、免疫組織化學和western blot檢測，結果表明：（1）三種AD模型大鼠均出現(xiàn)明顯海馬和皮層病理改變，但程度不同。在對照組，海馬 CA1區(qū)多層神經(jīng)元整齊排列，神經(jīng)元邊界清楚，細胞核形態(tài)正常。在ApoE4組，僅出現(xiàn)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列輕度紊亂，部分細胞間隙

29、略增大。在Aβ1-40組和聯(lián)合給藥組，均可見海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，神經(jīng)元數(shù)目和層數(shù)明顯減少，細胞形態(tài)不規(guī)則、大小不一，細胞間隙明顯增大，但在聯(lián)合給藥組大鼠的海馬病變更為明顯。同時，在三種AD模型大鼠的皮層均有淋巴細胞和小膠質(zhì)細胞增多，以聯(lián)合給藥組病變更為明顯；Aβ1-40組和聯(lián)合給藥組還可見有軟化灶出現(xiàn)，（2）三種 AD模型海馬和皮層出現(xiàn)不同程度的Aβ免疫陽性細胞。對照組未見明確Aβ陽性細胞；ApoE4組可見散在陽性細胞；Aβ1-

30、40組及聯(lián)合給藥組可見大量的陽性細胞，但聯(lián)合給藥組的陽性細胞數(shù)最多。（3）不同 AD大鼠模型表現(xiàn)出不同程度的 pTau（S396）增加。Aβ1-40組和 ApoE4組 pTau(S396)/Tau的值分別為0.969±0.038和1.048±0.041，與對照組的0.606±0.047相比均明顯升高（P<0.01），但兩種AD模型組之間無明顯差異（P>0.05）。在聯(lián)合給藥組大鼠，pTau(S396)/Tau值為1.275±0.051，

31、不僅明顯高于對照組（P<0.01），而且也明顯高于單獨給予Aβ1-40或apoE4組（P<0.01）。
　　結論：
　　（1）在給藥后2周，三種AD大鼠模型組與對照組海馬T2值無明顯差異，提示T2值不是診斷早期AD的可靠方法。在給藥后4周，三種AD大鼠模型海馬T2值均增高，但聯(lián)合給藥組T2值增高更加明顯，推斷T2值增高可能提示AD的存在，而且與AD的嚴重程度相關。（2）在給藥后不同時間點，三種AD大鼠模型與對照組海馬NAA/

32、Cr+Cr1相比均存在顯著性差異，提示NAA濃度在AD早期就發(fā)生變化，且與AD的嚴重程度相關。（3）三種AD模型均可明顯損傷大鼠的空間學習記憶能力，但損傷程度有差異，聯(lián)合給藥組的損傷較單獨給予Aβ1-40或apoE4組更為嚴重。結合1H-MRS，NAA/Cr+Cr1在AD早期就發(fā)生變化，且不同AD模型NAA濃度減低程度不同，提示NAA/Cr+Cr1減低可能比行為學實驗更敏感。（4）三種AD模型的LTP均受到明顯壓抑，但以聯(lián)合給藥組LTP

33、的損傷更為嚴重。結合1H-MRS，NAA/Cr+Cr1在給藥后2周就發(fā)生變化，給藥后4周持續(xù)性減低，且三種AD大鼠模型之間NAA濃度減低程度不同，提示NAA/Cr+Cr1對于AD診斷具有較高的敏感性。（5）三種AD模型組均出現(xiàn)包括Aβ沉積和tau蛋白磷酸化在內(nèi)的典型AD樣病理改變，但以聯(lián)合給藥組病理改變較單獨給予Aβ1-40或apoE4組更為嚴重。三種AD模型所出現(xiàn)的病理改變嚴重程度與在磁共振檢查、行為學和電生理實驗中所觀察到的指標改變