CLC-3蛋白在糖尿病大鼠主動脈平滑肌，腎臟及腦組織中的表達及變化的研究.pdf

1、研究目的：本課題擬采用分子生物學(xué)檢測方法，在糖尿病形成的不同時期(2周、4周、8周、12周、16周)，觀察大鼠主動脈平滑肌，腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)及腦組織CLC-3蛋白的表達。從分子生物學(xué)角度探討在糖尿病高滲透壓狀態(tài)下，CLC-3蛋白如何發(fā)生變化。并探討其可能機制，為揭示糖尿病時血管功能的損害機制及其藥物研制的新靶點提供理論依據(jù)。 研究方法：選用50只200～250g正常雄性Wistar大鼠一次性腹腔注射STZ誘導(dǎo)成糖尿病后，隨機分成五

2、個時間點，即2周，4周，8周，12周和16周。另外取50只年齡、體重相匹配的正常雄性Wistar大鼠作為正常對照組。每個時間點處死動物十只。迅速取出各組主動脈、腎臟(皮質(zhì)、髓質(zhì))及腦組織。取不同時期大鼠相應(yīng)待測組織放入預(yù)冷的PBS緩沖液中，把動脈周圍結(jié)締組織剪干凈去除血塊洗三遍，加入三倍組織量的組織裂解液，在冰浴下用組織勻漿器勻漿，將組織完全裂解呈乳狀，高速低溫(4℃)離心機3000g，在4℃，離心5min，取上清后再次離心，腎臟皮質(zhì)，

3、髓質(zhì)以及腦組織用PBS沖洗三遍后，離心機12000g在4℃，離心2min，取上清，將上清液置于EP管中，放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?可保存1周)。取少量蛋白上清液用考馬斯亮蘭法定量后，調(diào)整蛋白量，使每個加樣孔中蛋白量相同。加入6×上樣緩沖液(為上樣液的1/5量)沸水中煮3-5分鐘，迅速冰浴(0℃)3分鐘，混勻。與5ulMarker一起進行SDS-PAGE電泳，約2h，電泳分離蛋白質(zhì)然后卸下分離膠，置于電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡30min。轉(zhuǎn)移到硝酸

4、纖維素膜上，PBST洗脫液沈脫5min。將卸下的硝酸纖維素膜浸于封閉液(5％脫脂奶粉)中，室溫下在搖床緩慢搖勻1小時，取出膜后，在將膜放入CLC-3多克隆抗體與β-actin抗體(混合液中，在搖床上緩慢搖勻孵育1小時，PBST室溫洗脫1小時，將硝酸纖維素膜放入在HRP-結(jié)合的二抗室溫下共同孵育1小時，PBST洗脫1小時，每3分鐘取發(fā)光試劑盒中的發(fā)光底物溶液和增強劑溶液各0.25ml，加入去離子水稀釋至5ml，混勻靜置1分鐘后，與膜作用3

5、min，在暗室中，使X片感光。膠片用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析灰度。 統(tǒng)計學(xué)處理： 所有實驗數(shù)據(jù)均采用(-X)±S表示，組間分析用MicrosoftExcelt檢驗，p＜0.05視為有統(tǒng)計學(xué)意義。 試驗結(jié)果： 1.用抗CLC-3的多克隆抗體在大鼠主動脈平滑肌，腎臟皮質(zhì)與髓質(zhì)以及腦組織上均檢測到內(nèi)源性CLC-3蛋白的表達，它們的分子量在80KDa-110KDa之間。 2.糖尿病大鼠主動脈平滑肌上CLC-3

6、蛋白的表達在2周后升高，在第8周和12周時表達與對照組有顯著性差異(P＜0.05). 3.糖尿病大鼠腎臟皮質(zhì)上CLC-3蛋白的表達在第2周到12周時均升高，在第16周時表達降低，與對照組沒有顯著性差異。髓質(zhì)上CLC-3蛋白的表達在第2周到16周時均降低，在第12周和16周時表達與對照組有顯著性差異(P＜0.05)。 4.糖尿病大鼠腦組織上CLC-3蛋白的表達在第2周到16周時均升高，在第12周和16周時表達與對照組有顯著

7、性差異(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.免疫印跡表明大鼠主動脈平滑肌，腎臟皮質(zhì)與髓質(zhì)以及腦組織上均檢測到內(nèi)源性CLC-3蛋白的表達，它們的分子量在80KDa-110KDa之間。 2.糖尿病大鼠發(fā)病早期第2周到第4周時主動脈平滑肌，腎臟皮質(zhì)與髓質(zhì)以及腦組織上CLC-3蛋白的表達與對照組均沒有顯著性差異，在中后期第8周開始有顯著性變化。 3.糖尿病大鼠主動脈平滑肌，腎臟皮質(zhì)及腦組織上CLC-3蛋白的表達在糖尿病