快速檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒免疫膠體金診斷試紙條的研制.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)屬于動脈炎病毒科(Arteriviridae),動脈炎病毒屬(Arterivirus)，可引起懷孕母豬流產、早產及斷奶仔豬肺炎、生長遲緩等癥狀，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴重經濟損失。因此，建立能夠對PRRSV進行現(xiàn)地快速檢測的、簡便的診斷方法是十分必要的。 本試驗采用差速離心和蔗糖密度梯度離心法純化病毒抗原，按常

2、規(guī)方法免疫BALB/c小鼠，利用雜交瘤細胞技術融合小鼠脾細胞與SP2/0細胞，融合率為91.4％。用建立間接ELISA方法檢測雜交瘤細胞上清，結果陽性率為20.6％。采用有限稀釋法進行3次克隆，獲得了5株抗PRRSV單克隆抗體(McAb)，分別命名為D5、D7、D10、E9和B5。5株McAb腹水的效價分別為1:25600、1:12800、1:6400、1:12800和1:6400。免疫球蛋白亞類鑒定結果顯示，D5和B5屬于IgG2b亞

3、類，D7、D10和E9屬于IgM亞類，而其輕鏈均為κ鏈。用原核表達的PRRSVN蛋白對家兔進行多次免疫，制備了兔抗PRRSVN蛋白抗體。 免疫膠體金診斷試紙條具有快速、簡便等優(yōu)點，結合單克隆抗體技術又有良好的特異性和敏感性，是目前現(xiàn)地應用最廣泛的一種診斷方法。本試驗利用檸檬酸三鈉還原法制備粒徑約為20nm的膠體金，選擇抗體效價高，反應活性好且亞類為IgG2b的D5McAb與20nm的膠體金顆粒結合制備探針，同時將純化的兔抗PRR

4、sVN蛋白抗體和羊抗鼠lgG包被硝酸纖維素膜(NCM)分別作為檢測線(T線)和質控線(C線)，組裝成檢測PRRSV的免疫膠體金診斷試紙條。敏感性試驗結果表明，本試驗組裝的免疫膠體金診斷試紙條可以檢出6.25μg/mL純化的PRRSV抗原。在特異性試驗中，用所組裝的試紙條對豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬細小病毒(PPV)進行檢測，結果顯示，該試紙條只能夠