魚(yú)類(lèi)淋巴囊腫病毒(LCDV)膠體金免疫層析試紙條的研制.pdf

1、魚(yú)類(lèi)淋巴囊腫病(Lymphocystis disease,LCD)是一種典型的皮膚和淺表組織慢性病毒性疾病,其呈世界性分布,可感染已知至少42科140種以上的海水、半咸水和淡水魚(yú)類(lèi),是對(duì)魚(yú)類(lèi)危害較為嚴(yán)重的病毒病之一。魚(yú)類(lèi)淋巴囊腫病病原為淋巴囊腫病毒(Lymphoeystis disease virus,LCDV)。目前LCDV的檢測(cè)方法主要是組織病理技術(shù)、電鏡技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、免疫檢測(cè)技術(shù)和分子檢測(cè)技術(shù)等。這些檢測(cè)方法在準(zhǔn)確性、靈敏性

2、、安全性和花費(fèi)等方面有各自的優(yōu)點(diǎn),但是它們不同程度上受到需要專(zhuān)業(yè)人員和復(fù)雜儀器的限制。膠體金免疫層析技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀(guān)等特點(diǎn),而單克隆抗體技術(shù)具有良好的特異性和靈敏度,本論文將兩者結(jié)合旨在建立克服上述局限性的魚(yú)類(lèi)LCDV膠體金免疫層析試紙條。
　　 將3株分泌小鼠抗LCDV囊膜蛋白單克隆抗體(單抗)的雜交瘤細(xì)胞株1B2、1D7和2D11擴(kuò)大培養(yǎng),并腹腔注射BALB/c小鼠制備抗LCDV腹水單抗。利用辛酸-硫酸銨法純化腹

3、水單抗,純化后的單抗經(jīng)SDS-PAGE分析,IgG重鏈和輕鏈區(qū)帶明顯,蛋白純度較高,適合檢測(cè)和膠體金的標(biāo)記;Western blotting分析抗LCDV單抗的抗體類(lèi)型,3株單抗均屬于IgG類(lèi);免疫熒光實(shí)驗(yàn)和斑點(diǎn)免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明3株單抗特異性地與LCDV結(jié)合;間接ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)得腹水單抗1B2、1D7和2D11的效價(jià)分別為:1:25600、1:12800和1:25600;相加ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行抗原表位分析,結(jié)果顯示3株單抗識(shí)別不同的抗

4、原表位。通過(guò)分析測(cè)定單抗的抗體類(lèi)型、特異性、效價(jià)和抗原表位,選擇抗體類(lèi)型是IgG類(lèi)、特異性好、效價(jià)較高、識(shí)別不同抗原表位的單抗1B2和2D11分別用作捕獲抗體和標(biāo)記抗體。
　　 采用雙抗體夾心原理制備魚(yú)類(lèi)LCDV膠體金免疫層析試紙條。以微波爐作為加熱容器,利用檸檬酸三鈉還原法制備了粒徑大小約為20 nm單分散系的膠體金。肉眼觀(guān)察制備的膠體金呈紅色,紫外可見(jiàn)光譜分析和透射電鏡觀(guān)察膠體金顆粒分布均勻、大小一致。通過(guò)探索膠體金與單抗2

5、D11的最佳標(biāo)記條件,確定膠體金與單抗的標(biāo)記pH值為8.2,穩(wěn)定膠體金的單抗標(biāo)記用量為18μg/ml。以最佳標(biāo)記pH值和最佳標(biāo)記蛋白量對(duì)膠體金進(jìn)行單抗標(biāo)記,紫外可見(jiàn)光譜分析和透射電鏡觀(guān)察膠體金吸附上單抗,經(jīng)免疫滲濾法鑒定制備的金標(biāo)抗體具有良好免疫活性。將金標(biāo)抗體噴涂于玻璃纖維膜上制成金標(biāo)墊,單抗1B2和羊抗小鼠IgG抗體分別包被于硝酸纖維素膜(NC膜)上作為檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)制成NC膜檢測(cè)層,與樣品墊、吸收墊和塑料底板組裝成魚(yú)類(lèi)LCDV膠體

6、金免疫層析試紙條。對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn),篩選出合適的魚(yú)類(lèi)LCDV膠體金免疫層析試紙條制作材料。確定了金標(biāo)抗體的最適稀釋倍數(shù)為1:2,單抗1B2和羊抗小鼠IgG抗體的最適包被濃度分別為1 mg/ml和0.5 mg/ml。
　　 用魚(yú)類(lèi)LCDV膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)樣品,若待測(cè)樣品中含有LCDV,NC膜上檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)顯示肉眼可見(jiàn)的紅線(xiàn),若待測(cè)樣品中無(wú)LCDV則只在質(zhì)控線(xiàn)出現(xiàn)紅線(xiàn),整個(gè)反應(yīng)過(guò)程可在10 min內(nèi)完成。魚(yú)類(lèi)LCDV膠體